Bisfenol A’nın SH-SY5Y Nöroblastoma Hücrelerindeki Asetilkolinesteraz Gen Ekspresyonuna Olan Etkilerinin Nitrik Oksit Sentaz Aracılığıyla İncelenmesi

Abstract

In this study, SH-SY5Y human neuroblastoma cells treated with low doses of Bisphenol A (BPA). Bisphenol A is a commonly used endocrine disruptor. The cytotoxicity of BPA to SH-SY5Y cells was determined by MTT and LDH assays, and NO levels were determined by the Griess method. The acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) gene expression levels of the cells were determined by RT-PCR and enzyme activities by the Ellman method. % Populations of cells were determined by Tali cytometer and TNFα and caspase-8 levels were measured with Elisa kits. It was determined that % viability of cells gave a non-monotonic dose response and a correlation between cytotoxicity results and NO levels. The IC50 values for AChE and BuChE enzymes were found to be 2.2 mM and 1.98 mM, respectively. The AChE gene expression level with 1 pM and 1 nM BPA at 48 hours was changed to 0.61 and 1.03 respectively and BuChE gene expression level was changed to 2.18 and 0.73 in comparison with the control. 1 pM BPA and 1 nM BPA decreased TNF-α levels to 0.073 and 0.084 respectively, at 48 hours. At 24 hours, it was determined that only 1 pM BPA treatment decreased TNF-α levels to 0.302. Caspase-8 levels were increased to 168.4%, 297.3% and 287%, 160.2% at 24 and 48 hours with 1 pM and 1 nM BPA, respectively. The apoptotic % cell population with 1 pM BPA and 1 nM BPA increased sequentially at 6 hours (7.3%, 7.7%) and decreased at 48 hours (1.3%, 1%) while the necrotic cell population decreased in 4. and 6. hours (20.3%, 18.3% -19.3%, 21.3%) and increased in 48 hours (23.7%, 27%). The results of this study demonstrate that cell switches from apoptosis to a necroptosis, a programmed death, at 48 hours by applying 1 pM and 1 nM BPA to SH-SY5Y cells.İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER DİZİNİ xv TABLOLAR DİZİNİ xvii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 9 2.1 SH-SY5Y Nöroblastoma Hücre Hattı 9 2.2 Bisfenol A (BPA) 9 2.3 Östrojen 15 2.3.1 Östrojen Reseptörleri 16 2.3.2 BPA’nın Östrojen Reseptörü Üzerine Etkileri 16 2.3.3 BPA’nın Östrojenin Beyindeki Rolüne olan Etkileri 18 2.4 Nitrik Oksit Sentaz (NOS) 20 2.5 Kolinesterazlar ve Kolinerjik Sistem 22 2.5.1 Kolinesteraz Enzimlerinin Moleküler Formları 24 2.5.2 Kolinesteraz Enzimlerinin Aktif Merkez Yapısı 26 2.5.3 Kolinerjik Antiinflamatuar Yolak 27 2.6 Apoptoz 29 2.7 Nekroptoz 32 2.8 Nekroz 34 3. GEREÇLER VE YÖNTEMLER 36 3.1 Gereçler 36 3.1.1 Hücreler 36 3.1.2 Kimyasal Maddeler ve Kitler 36 3.1.3 Cihazlar 37 3.2 Yöntemler 38 3.2.1 Hücre Kültürü 38 3.2.2 Thoma Lamı ile Hücre Sayımı 39 3.2.3 MTT Sitotoksisite Deneyi 39 3.2.4 Nitrik Oksit (NO) Düzeyinin Griess Yöntemiyle Ölçülmesi 40 3.2.5 Laktat Dehidrogenaz (LDH) Deneyi 41 3.2.6 SH-SY5Y Hücrelerinin Plakalara Ekilmesi 42 3.2.7 SH-SY5Y Hücrelerinden RNA Eldesi ile RNA’ların Miktar ve Saflık Tayini 42 3.2.8 RNA için Denatüre Edici Agaroz Jelin Hazırlanması ve RNA’ların Jel Görüntüsünün Eldesi 43 3.2.9 SH-SY5Y RNA’larından cDNA Eldesi 43 3.2.10 Kantitatif Eş Zamanlı PCR Yöntemi ile Gen Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi 44 3.2.11 Gen Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi Amacıyla Tasarlanan Primerlerin Dizileri 45 3.2.12 BPA’nın AChE ve BuChE Enzim Aktivitesine Etkisi 45 3.2.13 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 46 3.2.14 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TNF-α Düzeylerinin Belirlenmesi 48 3.2.15 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Kaspaz-8 Düzeylerinin Belirlenmesi 48 3.2.16 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Tali Görüntülü Hücre Sitometresi ile Değerlendirilmesi 49 3.2.17 İstatiksel Değerlendirme 50 4. BULGULAR 51 4.1 SH-SY5Y Hücrelerinin Işık Mikroskobuyla Elde Edilen Görüntüsü 51 4.2 BPA’nın SH-SY5Y Hücrelerinde Sitotoksik Etkisi 51 4.2.1 Mtt Sitotoksisite Deneyi 51 4.3 SH-SY5Y Hücrelerinde nNOS Gen Ekspresyon Düzeyi Sonuçları 53 4.4 Nitrik Oksit (NO) Düzeyinin Griess Yöntemiyle Ölçüm Sonuçları 54 4.5 Laktat Dehidrogenaz (LDH) Deneyi 58 4.6 SH-SY5Y Hücrelerinden Elde Edilen RNA Örnekleri ile İlgili Sonuçlar 59 4.7 SH-SY5Y Hücrelerinden Elde Edilen RNA Örneklerinin Jel Görüntüleri 60 4.8 SH-SY5Y Hücrelerinden Saflaştırılan RNA’lardan Oluşturulmuş cDNA’lerin Miktar ve Saflık Tayini 61 4.9 SH-SY5Y Hücrelerinde AChE ve BuChE Genlerinin Ekspresyon Düzeyi Sonuçları 61 4.1 BPA’nın AChE ve BuChE Enzimleri için IC50 Değerlerinin Belirlenmesi 63 4.2 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 64 4.2.1 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücre Örneklerindeki Protein Miktarının belirlenmesi 64 4.2.2 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücre Örneklerindeki Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 65 4.3 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TALİ Görüntülü Hücre Sitometresi ile Değerlendirilmesi 67 4.4 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TNF-α Düzeyleri 71 4.5 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Kaspaz-8 Düzeyleri 72 5. TARTIŞMA 75 6. ÖNERİLER 81 KAYNAKLAR 82 ÖZGEÇMİŞ 93  Bu tez çalışmasında SH-SY5Y hücrelerine düşük dozlarda Bisfenol A (BPA) uygulanmıştır. BPA endüstride sıklıkla kullanılan bir endokrin bozucu maddedir. BPA’nın SH-SY5Y hücrelerin olan sitotoksisitesi MTT ve LDH deneyleriyle, NO düzeyleri Griess yöntemiyle belirlenmiştir. Hücrelerin asetilkolinesteraz (AChE) ve butirilkolinesteraz (BuChE) gen ekspresyon düzeyleri RT-PCR, enzim aktiviteleri Ellman yöntemiyle belirlenmiştir. Hücrelerin % popülasyonları Tali sitometresi ile TNFα ve kaspaz-8 düzeyleri Elisa kitlerle ölçülmüştür. Hücrelerin % canlılık değerinin monotik olmayan doz cevabı verdiği ve sitotoksisite sonuçları ile NO düzeyleri arasında bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir. BPA’nın AChE ve BuChE enzimleri için IC50 değeri sırayla 2,2 mM ve 1,98 mM bulunmuştur. 48 saatte 1 pM ve 1 nM BPA, AChE gen ekspresyon düzeyini kontrole göre sırasıyla 0,61 ile 1,03’e; ve BuChE gen ekspresyon düzeyini sırayla 2.18 ve 0,73’e değiştirdiği gözlenmiştir. Spesifik AChE aktivitesinin; 1 pM BPA uygulamasıyla 2. ve 12. saatte arttığı, 4. saat sonunda ise azaldığı görülmüştür. 1 nM BPA uygulamasıyla 4 saatte spesifik AChE enzim aktivitesi artmıştır. 1 pM BPA ve 1 nM BPA uygulamasının 48. saatte TNF-α düzeyini sırasıyla 0,073’e ve 0,084’e azalttığı görülmüştür. 24. saatte ise sadece 1 pM BPA’nın 0,302’e azalttığı belirlenmiştir. Kaspaz-8 düzeyi 24. saatte 1 pM ve 1 nM BPA ile sırasıyla % 154,7 ve % 287’lik; 48. saatte ise % 297,3 ve %160,2’lik artış göstermiştir. 1 pM BPA ve 1 nM BPA ile apoptotik % hücre popülasyonu sırayla 6. saatte (%7,3, %7,7) artıp 48. saatte (%1,3, %1) azalırken nekrotik % hücre popülasyonu ise 4. ve 6. saatte (%20,3; %18,3-%19,3; %21,3) azalıp 48. saatte ise (%23,7, %27) artmıştır. Bu tez çalışmanın sonuçları SH-SY5Y hücrelerine 1 pM ve 1 nM BPA uygulanmasıyla 48 saatte hücrenin apoptozdan yine programlı bir ölüm şekli olan nekroptoza doğru yöneldiğini ortaya koymaktadır