The binding of PD-1 to its ligands (PD-L1 and PD-L2) inhibits and/or regulates T cell responses. Myeloid leukemia cells can express both co-activatory and co-inhibitory molecules simultaneously. The function of PD-L1 in regulation of antitumor responses is well-known. Although under physiological conditions, PD-L2 is expressed on mature antigen presenting cells (APCs), it can also be highly expressed on monocytic leukemia that is composed of immature blasts. In this study, THP-1 was used as monocytic leukemia cell line and it resembles to primary monocytes. Monocytes were cultured in vitro to differentiate, while THP-1 cells were differentiated into monocyte/macrophage-like cells with protein kinase C activator, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and these cells were called “pTHP-1 cells”. Then, the expression of PD-1 ligands and B7 molecules were modulated and their effect on T helper responses was evaluated. Primary monocytes used as controls were maturated in suspension in vitro. By this way, the expressions of B7 molecules (especially PD-L2) were modulated and morphologically, macrophage-like cell type was obtained. However, because PD-L1 could not have been upregulated on pTHP-1 cells and cultured monocytes, THP-1 and pTHP-1 were stimulated with IFN-γ as a critical cytokine in anti-tumor responses. These cells were co-cultured with Th cells or peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). In the co-cultures, the first signal was provided by anti-CD3 mAb and the second signal was provided by co-stimulatory molecules expressed on monocyte/macrophage-like cells. Although THP-1 cells and monocytes resemble to each other, they behaved differentially. It was also found that the effect of THP-1 cells on Th cells was generally maintained through co-stimulatory mechanisms. Upon IFN-γ treatment, monocytes gained less stimulatory character. When PD-L2 molecule was blocked on IFN-γ-treated and control monocytic cells, it led to increase in the proliferation of Th cells and promote Th1 differentiation. Upon PD-L2 blockade, especially in the co-cultures with control monocytes, the production of Th2-related cytokines were also increased. To confirm the results, HEK293T cells were transfected with PD-L1, PD-L2 and CD86 genes. No Treg differentiation or T cell exhaustion was observed. On the other hand, blockade of PD-L2 molecule promoted immune activation. Consequently, in this study, the immune modulatory effects of PD-L2 on primary monocytes cells and on monocytic leukemia cells were compared and novel findings were obtained.Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Birimi (Proje No: TSA-2017-12739).PD-1 reseptörü ve ligandları (PD-L1 ve PD-L2), T lenfosit yanıtını inhibe eder ve/veya düzenler. Miyeloid lösemi hücreleri hem ko-aktivatör hem de koinhibitör molekülleri eş zamanlı olarak hücre yüzeyinde ifade etme kapasitesine sahiptir. PD-L1’in kanserde immün düzenlenme üzerine etkisi daha net olarak bilinmektedir. Fizyolojik koşullar altında, PD-L2 matür antijen sunan hücrelerin üzerinde bulunmasına rağmen, immatürite ile karakterize olan monositik lösemilerde de yüksek düzeyde bulunmaktadır. Bu çalışmada, monositlere olan benzerliğiyle bilinen monositik lösemi hücre hattı THP-1 kullanılmıştır. Monositler in vitro kültür ve THP-1 hücreleri de protein kinaz C aktivatörü, forbol 12-miristat 13-acetat (PMA) etkisi altında farklılaştırılarak (pTHP-1 hücreleri) alternatif monositik/makrofajbenzeri hücre türevleri yaratılmıştır. Bu hücrelerin karakterizasyonunun ardından, PD-1 ligandlarının ve diğer B7 ailesi kostimülatör moleküllerinin ekspresyonu modüle edilmiş ve yardımcı T hücre yanıtlarına etkileri değerlendirilmiştir. Kontrol olarak kullanılan primer monositler süspansiyon kültürde olgunlaşma basamağına itildi. Bu şekilde B7 ailesi kostimulatör moleküllerinin (özellikle PD-L2’nin) modülasyonu sağlandı ve morfolojik olarak makrofaj-benzeri bir hücre tipi elde edildi. Ancak, hem pTHP-1’de hem de kültürde bekletilen monositlerde PD-L1 yüksek düzeyde upregüle edilemedi. Bu yüzden, THP-1, pTHP-1 ve primer kültürdeki monositler her iki PD-1 ligandını artıran ve anti-tümör yanıtlarda da önemli rol oynayan IFN-γ ile muamele edildi. Bu hücreler yardımcı T lenfositler ve/veya periferik kan mononükleer hücreleri ile bir arada tutuldu. Gerçekleştirilen bu ko-kültürlerde ilk sinyal anti-CD3 antikoru aracılığıyla verilerek, ikinci sinyalin monositik/makrofaj-benzeri hücrelerdeki kostimülatör moleküller aracılığıyla verilmesi sağlandı. THP-1 ve monositlerin benzerliklerinin yanı sıra oldukça farklı davranabildiği görüldü. THP-1’in yardımcı T hücreler üzerindeki etkisinin büyük ölçüde kostimülasyon mekanizmaları üzerinden gerçekleştiğine dair bulgular elde edildi. IFN-γ ile muamele edilmiş monositik hücrelerin daha az uyarıcı olduğu gözlendi. Gerek kontrol gerekse IFN-γ ile muamele edilen monositik hücreler varlığnda PD-L2 molekülü bloklanarak yardımcı T hücre proliferasyonunun ve Th1 dönüşümünün arttığı gözlemlendi. Th1-ilişkili sitokinlerin yanısıra özellikle kontrol monositlerde PD-L2’nin blokajı ile Th2-ilişkili sitokin artışları da izlendi. Proliferasyon bulguları PD-L1, PD-L2 ve CD86 genleri aktarılan HEK293T hücreleri ile de doğrulandı. Treg dönüşümü veya T hücre yorulması izlenmedi. Diğer taraftan, PD-L2’nin tek başına inhibe edilmesi de önemli ölçüde immün aktivasyon sağladı. Sonuç olarak, normal monositlerde ve monositik lösemi hücrelerinde bulunan PD-L2’nin immün yanıtları düzenleme yeteneği karşılaştırılmış ve önemli bilgiler elde edilmiştir