学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 長棟 輝行, 東京大学教授 山東 信介, 東京大学准教授 河原 正浩, 東京大学教授 津本 浩平, 東京大学教授 後藤 由季子, 東京大学准教授 伊藤 大知University of Tokyo(東京大学

TAN MODONG

談 莫東

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論	 文	 の	 内	 容	 の	 要	 旨	 
	 
	 
	 
論文題目	 	 	 一細胞アレイ化技術を用いたGPCR動態の	 
ハイスループット解析技術の開発	 
	 
	 
	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 氏	 	 名	 	 	 	 談	 莫東	 
	 
	 
	 
	 
	 
	 
	 
Gタンパク質共役型受容体（GPCR：G-protein	 Coupled	 Receptor）は、既知のタンパク
質の中では最大のスーパーファミリーを形成しており、生体内で増殖、分化、アポトー
シスなどの様々な細胞運命の決定に関わっていることが知られている。一部のGPCRはそ
の細胞内局在変化によって活性を調節しており、その局在変化を一細胞レベルで精度よ
く定量解析する方法は確立されていない。特に、非接着性の血球系細胞内のタンパク質
局在をマイクロウェルなどで解析しようとした場合、細胞の回転によって正確な局在変
化を解析することが困難である。そして、GPCRの蛍光標識についても、嵩高いGFPを融
合した場合にそのリガンド/環境依存的なシグナル活性が低下することがあり、小分子
により蛍光標識することが望ましい。	 
	 本論文では、血球系の細胞で多く発現していることが知られている３種のGPCRを、血
球系細胞由来の非接着性細胞であるBa/F3細胞（マウスプロB細胞）に発現させ、GPCR
のリガンド刺激/環境変化依存的な細胞内局在変化を一細胞レベルで解析する技術の開
発を行った。	 
	 対象としたGPCRは、pH感受性をもつことが知られているG2AとOGR1と（Leukotriene）
LTB4受容体であることが知られているBLT1の計3種である。それぞれのGPCRのN末端に
SrtAによる蛍光標識のためのSrtAタグ（LPETG5）を融合し、レトロウイルスベクターを
用いてBa/F3細胞に導入した。一細胞アレイの作製には光分解性リンカーをもつPEG脂質、
PBAM（Photocleavable	 Biocompatible	 Anchor	 for	 Membrane）を利用した。定量的なGPCR
局在変化を画像解析し、細胞膜領域と細胞内領域の2コンパートメントを考慮したGPCR
動態シミュレーションによりGPCRの細胞内移行速度定数と細胞膜への還流速度定数を
推定した。	 
	 プロトン感知性GPCRであるG2AあるいはOGR1を発現したBa/F3、1細胞アレイパターン
を転写したPBAM/コラーゲンコートガラス基板上に固定化後、SrtAにより蛍光標識した
G2A、OGR1の細胞外pH依存的な局在変化を一細胞レベルで解析した。その結果、G2AとOGR1
は、弱塩基性環境下で細胞内部に行こうし、弱酸性環境下で細胞膜へ還流することが明
らかになった。これらのGPCRは生理的条件から酸性側に偏った環境ではプロトン化して
膜に局在し、弱塩基性の生理的条件下で細胞内の初期エンドソームに内部移行させるこ
とでそのGPCRシグナルを抑制しているのではないかと考えられた。さらに、2コンパー
トメントモデルに基づいたGPCR動態シミュレーションの結果、G2Aの局在変化に関わる
速度定数はpH非依存的であったが、OGR1の細胞内移行速度定数と細胞膜への還流速度定
数は弱酸性環境下と比較して弱塩基性環境下で約2倍と大きくなることが示された。pH
感受性に関わるヒスチジンのペアがG2Aでは1つ、OGR1では2つ存在することがその特性
の差を生じた可能性がある。	 
	 次に、BLT1のLTB4依存的な内部移行とその細胞内C末端ドメインのセリン/スレオニン
側鎖のリン酸化によるシグナル活性の関連を調べるため、BLT1のC末端ドメインのセリ
ン、スレオニンを計7残基アラニン置換したリン酸化部位欠損変異体BLT1(Δphos)を作
製した。野生型BLT1とBLT1(Δphos)変異体を同時にLTB4刺激した結果、ともに内部移行
料は少ないことが分かった。また、LTB4刺激後の内部移行量・速度ともに差異はなく、
C末端ドメインのリン酸化とBLT1の細胞内移行には関連がないことが明らかになった。
細胞膜への還流速度定数はG2AやOGR1の5倍以上と大きかった。BLT1は細胞のLTB4に対す
る走化性を維持するため、常にリガンドを結合していないBLT1を提示する必要があり、
BLT1を速く膜に輸送し続けているからだと考える。	 
	 また、BLT1発現Ba/F3を、LTB4濃度勾配中で観察した結果、ごく一部の細胞で濃度勾
配依存的な指向性をもった形状変化とBLT1の仮足への局在が観察できた。しかし、基板
との接着が細胞の形状変化を抑制したのか、ほとんどの細胞では形状変化が観察されな
かった。今後、小面積の細胞接着領域をパターニングした一細胞アレイ上での観察を行
う必要があることが予想された。	 
	 以上本研究において、光分解性PEG脂質であるPBAMと光リソグラフィー技術を用いて
作製した一細胞アレイ上に固定した細胞上で発現したGPCRの刺激依存的局在変化を解
析する手法を確立した。そこで確立した一細胞アレイ作製技術と画像解析手法を基に、
プロトン応答性GPCRであるG2AとOGR1のpH依存的な局在変化の特性とLTB４依存的な
BLT1の局在変化を解析し、一細胞レベルでの特性を明らかにした。本系は、ハイスルー
プットな新規の化合物評価系や創薬プラットフォームを開発する新たな基盤となるの
ではないかと期待している。	 
	 


一細胞アレイ化技術を用いたGPCR動態のハイスループット解析技術の開発

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一細胞アレイ化技術を用いたGPCR動態のハイスループット解析技術の開発

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