学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 菅野 純夫, 東京大学教授 古川 洋一, 東京大学客員教授 本田 真也, 東京大学教授 佐藤 守俊, 東京大学准教授 合山 進University of Tokyo(東京大学

Furuhata Yuichi

古旗 祐一

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論文内容の要旨 
 
論文題目 間葉系幹細胞の分化制御：三次元細胞密度変化による遺伝子発現プロファイ
ル変化と CRISPR-Cas9システムを用いる遺伝子発現制御 
 
氏  名 古旗祐一 
 
【緒言】間葉系幹細胞（MSC）は骨髄，脂肪，胎盤などの様々な組織から採取可能な体性幹細胞
でありながら，高い多分化能と自己複製能を併せ持つ．そのため iPS細胞やES細胞と比べて腫
瘍化の危険性が低い，倫理的問題がないといった利点を有しており，細胞治療への応用が期待さ
れている．生体内におけるMSCの分化指向性は，増殖因子や細胞外マトリクスなどの細胞外微
小環境の変化と細胞内遺伝子ネットワークが連動して制御されている．こうした細胞内外の環境
と分化指向性の関係を理解し，生体内における分化応答を生体外で再現できれば，幹細胞研究や
再生医療に大きく貢献できると考えられる． 
MSC は骨芽や脂肪，軟骨や神経といった多様な細胞に分化可能であるが，中でも骨芽細胞及
び脂肪細胞には非常に効率的に分化する．さらにこの骨芽－脂肪分化軸は一方が促進されるとも
う一方が抑制される競合的な関係にあることが明らかとなっており，MSC 分化のモデル系とし
て非常によく研究されている．本博士論文において，私は骨芽－脂肪分化軸に焦点を当て，細胞
外微小環境の構築及び細胞内遺伝子ネットワークの直接的な活性化に基づく分化制御を試みた．
その結果，第 2章では「三次元細胞密度変化がMSCの骨芽分化誘導を運命づけること」を明ら
かとし，第 3章では「CRISPR-Cas9システムを用いる遺伝子制御がMSCの複数種の脂肪細胞
への分化を効率よく誘導可能であること」を見出した． 
三次元細胞密度変化による遺伝子発現プロファイル変化 
【研究背景】MSC の分化指向性を制御する要因として，増殖因子や細胞外マトリクスといった
生物的微小環境に加えて近年注目を集めているのが，培養基板の弾性や細胞の大きさ，密度とい
った物理的な微小環境である．例えば脳や筋肉，骨などの弾性を模倣した培養基板は，MSC に
おける各組織細胞への分化を促進する 1．こうした微小環境の中でも二次元培養系における細胞
密度は，MSCの分化指向性に大きな影響を及ぼすことが知られている．MSCは低細胞密度では
骨芽細胞へ，高細胞密度では脂肪細胞への分化指向性を示す 2．これまでに多くの研究グループ
が二次元細胞密度の影響を評価している．一方，細胞本来の生育環境である三次元培養環境にお
ける細胞密度効果は未解明であった．そこで私は三次元細胞密度評価系の構築及びMSC骨芽－
脂肪分化軸に対する三次元密度効果の解明を試みた． 
【結果】三次元細胞密度評価系の構築に当たり，大きさの揃った細胞凝集塊を作製可能なマイク
ロパタン培養皿に着目した．マイクロパタン培養皿は細胞接着性の領域と非接着性領域の 2 つ
から構成されており，細胞は白い円形の領域に接着する（図１）．本培養法では円形部分の直径を
小さく設定することで，通常の三次元培養に付随する酸素濃度の低下や老廃物の蓄積といった副
産物的要因を排除でき，三次元培養の効果のみを評価可能である 3．私は本培養基板上に細胞数
を変えてMSCを播くことで蓄積レベルの異なる細胞を作製し，三次元細胞密度評価系とした（図
1）． 
マイクロパタン培養皿に 1 ドメイン当たり 2 から 40 細胞まで段階的に細胞数を変えて MSC 
を播種し，蛍光染色を行った後，共焦点レーザー顕微鏡で観察した．その結果，1 ドメイン当た
り 4細胞までは，MSCは単層状の構造を形成していた（図 2）．一方で 8細胞以上の場合，積層
している様子が観察され，播種細胞数の増加に伴って，蓄積レベルが上昇していた．さらに細胞
凝集体中の一細胞の体積を推算したところ，蓄積に伴って細胞が小さくなっており，三次元細胞
密度が増加していることが明らかとなった．続いてMSCの分化能に及ぼす影響を評価するため，
リアルタイム PCR を用いて骨芽及び脂肪分化マーカーの発現量を測定した．その結果分化誘導
因子を添加していないにも関わらず，三次元細胞密度の増加に伴って骨芽分化マーカーの発現量
が大きく上昇した．一方で脂肪分化マーカーの発現量は変化しない，もしくは顕著に減少すると
いう興味深い挙動を示した．つまり三次元細胞密度が高い MSCは分化誘導前から骨芽分化に有
利な状態にあることが示唆された．そこで最大三次元密度のサンプルにおいて骨芽及び脂肪分化
を誘導したところ，三次元細胞密度は脂肪分化には影響しないが，骨芽分化を劇的に促進させ，
分化に必要な時間を大幅に短縮させることが明らかとなった（図 3）． 
【結論】本研究では，マイクロパタン培養を応用して三次元細胞密度評価系を構築し，三次元高
細胞密度が未分化状態のMSCの骨芽分化能を活性化し，脂肪分化能を抑制することを見出した
（図 4）．本知見は二次元培養系における細胞密度依存的な分化挙動とは正反対であり，MSCの
分化を方向付ける要因として三次元細胞密度の重要性を示すものである 3,4．さらに高密度な三次
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
図 1．マイクロパタン培養皿を利用する 
MSC の三次元細胞密度制御の概略図 
図 2．積層した MSC の（A）二次元及び（B）三次元蛍光
画像 
 
 
元培養環境に供することで，新規液性因子を添加することなくMSCの効率的かつ迅速な骨芽分
化を達成した． 
 
CRISPR-Cas9システムを用いる遺伝子発現制御 
【研究背景】第 2 章において，MSC の脂肪分化は三次元細胞密度を変化させても制御すること
ができなかった．分化応答は細胞内遺伝子ネットワークを経由して引き起こされるため，仮に内
在性脂肪分化関連遺伝子の転写を選択的に活性化することができれば，MSC の脂肪分化制御が
可能であると考えた．本目的を達成するため，近年開発されたCRISPR-Cas9システムに着目し
た．本システム由来の dCas9タンパク質は任意のDNA配列に結合可能であり，転写活性化因子
を融合することで内在遺伝子の転写を選択的に誘導できる．既に一遺伝子の機能解析から網羅的
な遺伝子スクリーニングに至るまで幅広く利用されており，線維芽細胞の筋分化や iPS 細胞の
神経分化といった分化制御への応用も報告され始めている 5．本システムでは従来の外来遺伝子
導入による分化制御では困難であった，内在遺伝子のエピジェネティックな制御や複数バリアン
トの同時発現誘導が可能であり，より生体内に近い分化誘導が可能だとされている．そこで私は
dCas9 タンパク質を用いて，MSC における脂肪細胞特異的な内在遺伝子の発現誘導及び脂肪分
化制御を試みた． 
【結果】内在遺伝子転写活性化システムとして，1つの dCas9タンパク質に対して複数種類の転
写活性化因子を誘導することで強力な転写活性化が可能な synergistic activation mediator（SAM）
システムを用いることとした（図 5）．まずレンチウイルスベクターを利用して SAMシステムを
MSC に導入し，脂肪分化制御因子である PPARG，CEBPA 及び KLF5 の発現制御を試みた．
その結果，どの遺伝子についても高効率な内在遺伝子発現誘導が観察された．続いて遺伝子転写
活性化によるMSC の脂肪分化誘導を試みたところ，PPARG または CEBPA の発現を誘導した
場合，大きな油滴を産生する脂肪細胞が多数観察された．さらに脂肪細胞マーカーの発現解析に
より，誘導された脂肪細胞は白色脂肪細胞であることが示唆された．一般的に，MSC は単胞性
の油滴を産生してエネルギーを貯蔵する白色脂肪細胞，さらに多胞性の油滴を産生して熱産生を
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
図 4．三次元細胞密度と MSC 分化能 図 3．積層したMSCの骨芽分化誘導
及び分化挙動評価 
 
担うベージュ脂肪細胞に分化可能であることが知られている 6．特にベージュ脂肪細胞は熱産生
を担うため，生体の代謝バランスを整えるのに必須であり，効率的な分化誘導方法の確立が望ま
れている．そこで私はベージュ脂肪細胞を特徴づける転写因子である PPARG，CEBPB 及び
PRDM16 の同時発現誘導による分化誘導を試みた．その結果 MSC における 3 遺伝子同時発現
誘導に成功し，さらに多胞性の小さな油滴を産生するベージュ脂肪様細胞の分化誘導に成功した
（図 6）．さらに本細胞はベージュ細胞のマーカーである TMEM26 及び SHOX2 を強く発現し
ていた． 
【結論】本研究では内在遺伝子の発現誘導により，MSC から白色脂肪様細胞とベージュ脂肪様
細胞を誘導することに成功した．本知見は多分化能を持つMSCの分化制御において内在遺伝子
制御の有効性を示すものであり，脂肪分化メカニズムの解明やMSCの臨床応用への貢献が期待
できる 7．  
【総括】本研究では細胞外微小環境における三次元細胞密度の効果を検証し，三次元細胞密度の
増加に伴いMSCの細胞内遺伝子ネットワークが骨芽分化に傾くという興味深い現象を明らかと
した．さらに CRISPR-Cas9 システムを利用することで，MSC の細胞内遺伝子ネットワークを
直接的に制御することに成功し，同システムがMSCの分化応答を選択的に誘導できることを示
した．これらの知見を組み合わせることで，既存の分化手法の効率化や新規分化誘導遺伝子の探
索，そして新たな細胞への分化誘導系の確立が期待される． 
【参考文献】 
(1) Engler, A. J., et al., (2006) Cell, 126, 677–689. 
(2) McBeath, R., et al., (2004) Dev. Cell, 6, 483–495. 
(3) Furuhata, Y., et al., (2016) Genes Cells, 21, 1380–1386. 
(4) Furuhata, Y., et al., (2017) ACS Appl. Mater. Interfaces, 9, 9339–9347. 
(5) Dominguez, A. A., et al., (2015) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 17, 5–15. 
(6) Giralt, M., et al., (2013) Endocrinology, 154, 2992–3000. 
(7) Furuhata, Y., et al., (2017) ACS Synth. Biol., in press. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 図 5．CRSIPR-Cas9 システムを用いた内在遺伝子発現
制御システム（SAM システム） 
図 6．内在遺伝子発現誘導による MSC の白色脂肪
細胞及びベージュ細胞への分化制御 


間葉系幹細胞の分化制御 : 三次元細胞密度変化による遺伝子発現プロファイル変化とCRISPR-Cas9システムを用いる遺伝子発現制御

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間葉系幹細胞の分化制御 : 三次元細胞密度変化による遺伝子発現プロファイル変化とCRISPR-Cas9システムを用いる遺伝子発現制御

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