学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学教授 小池 和彦, 東京大学講師 田中 敏明, 東京大学講師 赤松 延久, 東京大学准教授 藤城 光弘, 東京大学講師 立石 敬介University of Tokyo(東京大学

Sato Kazuhito

佐藤 一仁

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博士論文（要約） 
 
Actionable fusion kinases in sporadic  
microsatellite instability-high colorectal cancers 
 
（高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する 
孤発性大腸癌の治療標的となり得る融合キナーゼ） 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
佐 藤 一 仁 
	
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論文の内容の要旨 
 
論文題目 Actionable fusion kinases in sporadic microsatellite instability-high 
colorectal cancers 
（高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する孤発性大腸癌の治療標的となり得る
融合キナーゼ） 
 
氏名 佐藤一仁 
 
背景と目的 
 
 マイクロサテライト不安定性（MSI）とは、DNAの複製の際に生じる塩基配列の
間違いを修復する機能の低下により、ゲノム上に散在するマイクロサテライト反復
配列(CACACA 等)が腫瘍組織において正常組織と異なる反復回数を示す現象である。
National Cancer Institute (NCI)は、ベセスダパネル（1塩基反復配列マーカ
BAT25, BAT26、2塩基反復配列マーカD2S123, D5S346, D17S250）の計 5マー
カのうち、いずれか 2つ以上のマーカでMSI が検出されれば高頻度マイクロサテラ
イト不安定性(MSI-H)、１つのマーカで検出されれば低頻度マイクロサテライト不
安定性(MSI-L)、5 マーカとも検出されなければマイクロサテライト安定性(MSS)と
分類した。MSI-H のうち遺伝性のものをリンチ症候群(LS)と呼ぶ。LSではDNAミ
スマッチ修復(MMR)遺伝子の生殖細胞系列変異を有するため、もう一方のアレルに
後天的異常が加わるとMMR機構が損なわれる。それによりMSI が現れると共に癌
遺伝子や癌抑制遺伝子に変異が蓄積し癌化する(Vasen, Gut 2013)。 
 近年、BAT25 および BAT26 がMSI であるものを厳密なMSI-H とすべきである
と考えられるようになり(Jass, EJC 2002)、臨床的には BAT25 と BAT26 を含む１
塩基反復配列マーカを用いる Promega 社のパネルを用いることが多くなった。NCI
の定義するMSI-H 大腸癌が全大腸癌の約 10%を占めるのに対し、BAT25/BAT26
の両者がMSI である割合は約 5%に過ぎず、症例収集の難しさにより厳密なMSI-H
のみを対象とした研究はほとんど無い。 
最近、MSI-H が多くの体細胞変異すなわち変異関連抗原を有し免疫が賦活化され
るため、MSI-H では免疫チェックポイント阻害薬（抗 PD-1 抗体など）の奏効率が
高く、アメリカ食品医薬品局で MSI-H 癌に対する治療薬として承認された。ただし、
免疫チェックポイント阻害薬の薬価は高く肺臓炎などの副作用が報告されており、
非奏効のMSI-H 癌をどう見分けるかが喫緊の課題となっている。 
MSI大腸癌は再発後の予後が不良である（Guinney, Nat Med 2015）が、MSIを
サブタイプ分類して予後を検討した報告はほとんどない。 
本研究では、1998年3月から2016年6月までに東京大学および帝京大学で手術治
療された約2,800例の大腸腫瘍のうち、ベセズダパネルとPromega社のパネルで共
通に用いられている、BAT25/BAT26の両者がMSIを呈した149の厳密なMSI-H大腸
腫瘍の網羅的解析を行い、MSI-H大腸癌のサブタイプ分類、細胞性免疫、治療標的、
予後について検討した。 
 
方法と結果 
 
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【MSI-H 大腸腫瘍の分類】 
 
149 のMSI-H 大腸癌のうち 93例のMSI-H 大腸癌に対しメチル化アレイを行った
ところ、MMR遺伝子の一つであるMLH1メチル化の有無が明確であった。このた
め、MLH1のメチル化を分類の軸に用いることとし、MLH1メチル化によりMLH1
の発現がエピジェネティックに抑制（サイレンシング）されている 64の大腸癌を
MLH1メチル化(MM)大腸癌と名付けた。なお、MLH1以外の他のMMR遺伝子の
メチル化はいずれも観察されなかった。MMR遺伝子の生殖細胞系列変異を有する
リンチ症候群（LS）随伴大腸腫瘍が 22あった一方で、MMR遺伝子の生殖細胞系
列変異もMLH1サイレンシングも認めない腫瘍が 21あったが、これらはメチル化
アレイで LSと同じクラスターに分類されたため、これらの癌はリンチ様(Lynch-
like, LL)と名付けた。 
  
 MM大腸癌は、右側大腸に多いのに比し、LS随伴大腸腫瘍/LL 大腸癌は両側大腸
に観察された。MM群が LS/LL 群よりも、大腸癌手術時の患者年齢が高齢であり、
再発後の予後が不良であった。 
 
 
【全エクソン解析およびアレル別コピー数・変異シグナチャー・パスウェイ解析】 
 
 次に、149 のMSI-H 大腸腫瘍とそのペア正常部の全エクソン解析(WES)を行った
ところ、MM群では LS/LL 群よりも、挿入・欠失変異が多く、BRAFと RNF43 の
変異は頻発し、KRAS, APC, TCF7L2 の変異は低頻度だった。 
  
 WES に基づくアレル別のコピー数解析により TGFBR2, MLH1, CTNNB1 の
Uniparental disomy が LS/LL に特異的に観察された。また変異シグナチャー解析
により、PMS2 の変異を有する癌において高い割合で認められたシグナチャーが同
定された。 
  
 MSI-H 大腸腫瘍のパスウェイ解析ではWnt パスウェイ、RAS/RAF/Mitogen-
activated protein kinase パスウェイ、ヒストンH3メチル化関連パスウェイ、
DNA損傷応答パスウェイの変異が頻発していた。 
 
 
【免疫学的検討】 
 
 WESの結果、MSI-H大腸腫瘍の21%に免疫関連遺伝子の機能喪失型変異が見られ
たため、同遺伝子変異に着目してCD8の免疫組織染色を行った。同遺伝子変異型の
MSI-H大腸癌では、同遺伝子野生型のMSI-H大腸癌よりも腫瘍浸潤CD8陽性細胞数
が少ないことが観察された。 
  
 次に、cDNAを用いた T細胞受容体レパトア解析を行ったところ、MSS 大腸癌よ
りもMSI-H 大腸癌でより T細胞受容体が多様であった。また、T細胞受容体レパト
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アは、MSI-H 大腸癌の中では、CD8Bのmessenger RNAの発現と負の相関が認め
られた。 
 
 
【MSI-H 大腸癌のドライバ変異と機能解析】 
 
 トランスクリプトームシーケンス（RNA-seq）を行った 111 MSI-H 大腸腫瘍の
中で、KRAS, BRAF の発癌ドライバ変異を各々16%, 48%に認め、それらとは相互
排他的に 11の融合遺伝子が同定された。これら融合遺伝子の転写産物の発現を
RT-PCR で確認し、サンガーシーケンスにより融合キナーゼのゲノムレベルでの融
合部位を同定し、これら融合が後天的であることを確認した。 
  
 次に、同定した融合キナーゼを 3T3 細胞に高発現させ、フォーカスフォーメーシ
ョンアッセイにより造腫瘍能を確かめた。さらに、キナーゼ阻害剤アッセイにより
INSR, RET, NTRK1, NTRK3 融合遺伝子については、各キナーゼ阻害薬が特異的に
融合遺伝子の形質転換能を抑制することを明らかにしたが、BRAF融合遺伝子への
BRAF阻害薬（PLX7904）の抑制効果は特異的ではなかった。 
 
 
【費用対効果の高い融合キナーゼ検出法】  
 
 融合キナーゼを同定する目的で全MSI-H大腸癌に対して次世代シーケンサを行う
のは高価であり現実的ではない。そこで1998年3月から2016年6月までのRNA-seq
未施行であった13のMSI-H大腸癌と、2016年7月～2017年4月の185の原発性大腸
癌を用いて追加解析した。まずMSI検査を行い、MSI-Hであった場合に、
KRAS/BRAF変異をサンガーシーケンスで同定し、KRAS/BRAFドライバ変異がな
いMSI-H大腸癌に対して、RNA-seqを行ったところ、僅か10のKRAS/BRAFのドラ
イバ変異を持たないMSI-H大腸癌からNCOA4-RETとCUL1-BRAFの２つの融合キナ
ーゼを同定できた。 
 
 
【予後解析】 
 
 MSI-H 大腸癌の予後解析を行った。意義が不明な変異を野生型に含めると、
BRAF(V600E)は BRAF 野生型よりも有意に全生存率が不良であり（P = 2.3 × 10‒
2）、BRAF(V600E)は、BRAF 野生型から融合キナーゼを除いた群よりも全生存率
は不良であった（P = 9.5 × 10‒3）。一方、融合キナーゼを有する群はKRAS ドラ
イバ変異を有する群よりも再発後の予後が不良であった（P = 8.2 × 10‒3）。 
 
 
考察 
 
 これまでMSI-H 大腸癌は遺伝性か孤発性という２つの分類がなされてきたが、本
研究によりMSI-H 大腸癌はMM、LS、LL という３群に分けられることを明らかに
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した。これまで、臨床的にMSI-H と診断された場合に、LSを除外するためには全
MSI-H 症例に対してMMR遺伝子の追加精査を要したが、本研究によりMM群は
LS群とは異なることが明らかになったため、MLH1メチル化の有無を調べることに
より、LSを除外するための追加精査を必要としない症例が明らかになった。 
 CD8 の免疫染色で免疫関連遺伝子が欠損すると抗原提示が出来なくなる可能性が
示唆された。今後免疫チェックポイント阻害薬非奏効例に免疫関連遺伝子変異があ
るか確認できれば、同遺伝子変異をマーカとして免疫チェックポイント阻害薬の非
奏効群を予測可能となるかもしれない。 
 全大腸癌の 2%未満と言われている治療標的となり得る融合キナーゼが、本研究
では、全MSI-H 大腸癌の 10% (11/111)、KRAS/BRAF ドライバ変異のないMM 
MSI-H 大腸癌では 58% (11/19)と高頻度に認められることを明らかにした。 
 本研究では東京大学および帝京大学で集められたMSI-H 大腸癌の予後について解
析を行い、融合キナーゼを有する群では再発後の予後が不良であったが、症例数が
少なく他の因子を調整していない。今後、他施設において同様の方法で融合キナー
ゼを同定することが出来れば、より信頼性の高いデータとなり、各キナーゼ阻害剤
を用いた臨床研究へと発展する可能性がある。 


高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する孤発性大腸癌の治療標的となり得る融合キナーゼ

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高頻度マイクロサテライト不安定性を呈する孤発性大腸癌の治療標的となり得る融合キナーゼ

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