学位の種別: 課程博士審査委員会委員 : （主査）東京大学准教授 平山 和宏, 東京大学教授 久和 茂, 東京大学教授 堀本 泰介, 東京大学准教授 芳賀 猛, 国立感染症研究所獣医学部部長 森川 茂University of Tokyo(東京大学

Tian Deyu

田 德雨

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論文の内容の要旨 
 
 獣医学専攻 
平成 26年度博士課程 入学 
氏   名  田德雨 
指導教員名 平山和宏 
 
論文題目 Evaluation of Francisella tularensis ΔpdpC mutant as a candidate for live attenuated 
vaccine against tularemia using mouse and monkey models 
（マウスおよびサルモデルを用いた野兎病菌 Francisella tularensis ΔpdpC変異株の弱
毒生ワクチンとしての有用性の評価） 
 
 
野兎病は、細胞内寄生性グラム陰性菌である Francisella tularensis（野兎病菌）の感染によって
引き起こされる人獣共通感染症である。野兎病菌は 250 種以上の哺乳類、魚類、爬虫類や鳥類に
感染することが知られている。また、野兎病菌はヒトに対して 10 コロニー形成単位 (CFU) 以
下の菌量で感染し、抗生物質による適切な治療が無い場合、その致死率は約 5%から 30％と想定
されている。野兎病菌の高い感染性と致死率から、本菌が生物テロに使用される可能性が指摘さ
れており、ワクチン開発、病原遺伝子の特定、発症機序の解明等が世界各国で精力的に行われて
いる。 
1941 年に米国の患者の潰瘍病変部位から分離された野兎病菌 SCHU 株は、クローニングを経
た後に SCHU S4 株として樹立さた。現在では SCHU S4 株が強毒株として野兎病菌研究に広く使
用され、ヒト、サル、マウスに対する半致死量 (LD50) は 10 CFU 以下との報告がされている。
野兎病菌 SCHU株は米国国立衛生研究所 Rocky Mountain Laboratoriesから福島県の大原綜合病院
に 1958年に分与され、それ以降 30年間人工寒天培地による生菌継代が続けられた後、冷凍保管
された。野兎病菌 SCHU 株は、2002 年に大原綜合病院から国立感染症研究所に分与されたが、
分与された株は既に弱毒化しておりマウスに対して病原性を示さなかった（LD50＞10
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 CFU）。国
立感染症研究所の宇田博士らは、弱毒化していた野兎病菌 SCHU 株をマウスで 9 回継代し病原
性復帰株 SCHU P9株を樹立した。さらに、SCHU P9 株の pathogenicity determinant protein C (pdpC)
遺伝子を破壊した ΔpdpC 株はマウスに対する病原性を失うが、pdpC 遺伝子を相補すると病原性
が復帰することを明らかにした。私は、このように pdpC 遺伝子が野兎病菌の病原性に必須であ
ることから、ΔpdpC株が安全で有効なワクチンとして利用できるのではないかと考えた。 
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そこで本研究では、野兎病菌 ΔpdpC 株の弱毒生ワクチンとしての安全性と効果について、第
1 章ではマウスモデルを用いて、第 2章ではカニクイザルモデルを用いて解析した。 
 
第 1章. C57BL/6Jマウスモデルにおける野兎病弱毒生ワクチンとしての野兎病菌 ΔpdpCの評価 
 野兎病菌は哺乳類に対して極めて高い感染性と致死性を有し、生物テロに使用される可能性の
ある病原体として危惧されているが、日本において野兎病菌のワクチン開発は行われていない。
そこで、本章ではマウスに対して病原性を消失した野兎病菌 ΔpdpC 株に着目し、安全性とワク
チン効果について解析し以下の結果を得た。 
1. ΔpdpC株は、TargeTron mutagenesis システムを用いて強毒 SCHU P9 株の pdpC遺伝子にイン
トロンを挿入して pdpC遺伝子を破壊している。ワクチンの安全性の指標として、イントロ
ンが脱落して病原性復帰株が出現しないことを、マウスを用いて 10回継代して確認した結
果、イントロンは完全に保持されており病原性も低いまま維持されていた。このことから
ΔpdpC株は、病原性復帰のリスクがほとんどないことが分かった。 
2. ΔpdpC 株をマウスに筋肉内接種、皮下接種、経鼻接種したところ、接種 3 週間後のマウス
血清には、接種経路に係わらず野兎病菌に対する高い抗体価が誘導された。 
3. ΔpdpC株を筋肉内接種、皮下接種、経鼻接種したマウスに、同経路で強毒 SCHU P9株で攻
撃したところ、投与 3 週間後の生存率はそれぞれ 100%、60%、40%であった。一方、非免
疫群のマウスは全ての接種経路で全て死亡した。 
4. ΔpdpC株を皮下接種後、強毒 SCHU P9 株を経鼻接種で攻撃したところ、生存率は 38%であ
った。一方、非免疫群のマウスは全ての個体が死亡した。 
5. ΔpdpC株を皮下接種後、強毒 SCHU P9 株を経鼻接種で攻撃後 3日目の段階で、顕著な細胞
性免疫の誘導は観察されなかった。 
これらの結果から、野兎病菌 ΔpdpC が安全で有効なワクチン株であることが示唆された。ま
た、細胞性免疫の誘導能を改善すれば、さらにワクチン効果が高まると考えられた。 
 
第 2章. カニクイザルモデルにおける野兎病菌 ΔpdpC株の野兎病の防御効果 
 第１章では、マウスモデルにおける野兎病菌 ΔpdpC 株の安全性とワクチンとしての有効性を
明らかにした。第２章では、非ヒト霊長類であるカニクイザルを用いて、野兎病菌 ΔpdpC 株の
ワクチンとしての有効性を解析した。6頭のカニクイザルを各 2頭 3 群に分け、第 1群は野兎病
菌 ΔpdpC株を皮下接種 3週間後に強毒 SCHU P9 株を経気道接種で攻撃した。第 2群および第 3
群はプラセボ処置した 3週間後に、第 2群では強毒 SCHU P9 株を、第 3 群では ΔpdpC株を経気
道接種で攻撃した。尚、経気道接種による攻撃の際にはバイオテロを想定し、既に報告されてい
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るカニクイザルでの経気道接種による強毒株致死量（LD50＜10
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 CFU）の 10万倍以上（106 CFU）
を接種した。また、強毒 SCHU P9 株接種後に横臥等の重篤な症状を示した個体は安楽死処置を
実施した。これらの検討により以下の結果を得た。 
1. 野兎病菌 ΔpdpC 株で免疫後、強毒 SCHU P9 株を経気道接種で攻撃した第 1 群のカニクイ
ザルは、2頭中 1頭は発症せず、１頭は発症したが耐過した。 
2. プラセボ処置（非免疫）後、強毒 SCHU P9 株を経気道接種で攻撃した第 2 群のカニクイザ
ルは、2頭ともに熱、咳、食欲不振、横臥等の臨床症状を示し 7日および 11日目に安楽死
処置を実施した。一方、弱毒 ΔpdpC 株を経気道接種で攻撃した第 3 群のカニクイザルは、
2 頭ともに無症状であった。 
3. 病理組織学的解析から、安楽死処置を実施した第 2 群のカニクイザルの全臓器、組織は、
抗野兎病菌 LPS抗体で強く染色された。また第 2群のカニクイザルでは、肺病変が顕著に
認められ、マクロファージだけでなく II型肺胞上皮細胞に野兎病菌が感染していることが
明らかとなった。 
4. 野兎病菌 ΔpdpC 株で免疫されたカニクイザルは、ELISA、MA 試験、およびウエスタンブ
ロッティングの 3つの方法で、野兎病菌に対する抗体応答が確認された。 
以上の結果から、ΔpdpC 株はカニクイザルに対しても病原性がないことが確認された。さら
に、ΔpdpC株はカニクイザルに皮下接種で高いワクチン効果を示し、強毒 SCHU P9株の致死的
感染を防御した。これらの結果から、野兎病菌 ΔpdpC 株は弱毒生ワクチンとして有効であるこ
とが示唆された。 
 
 野兎病菌は哺乳類に対して高い感染性と致死性を有するが、迅速で適切な抗生物質による治療
を施せば、現状においては完治する感染症である。しかしながら、野兎病菌はプラスミドを容易
に獲得できることから、薬剤耐性プラスミドを持った野兎病菌がバイオテロに使用された際には
既知の抗生物質治療が有効でないことも想定される。このような薬剤耐性を獲得した野兎病菌に
対しては、ワクチンが最も安価で効果的な対策であることは疑う余地はない。本研究の第１章で
はマウス発症モデルを用いて、第２章ではカニクイザル発症モデルを用いて、野兎病菌 ΔpdpC
の生ワクチンとしての安全性と、強毒株の致死的感染を防御する高い効果が確認された。マウス
の発症モデルでは、ワクチン接種経路として多く用いられている皮下接種では、バイオテロに用
いられた場合に想定されるエアロゾル化された野兎病菌による経気道感染に対してはワクチン
効果が限定的であったが、カニクイザルの発症モデルでは ΔpdpC を皮下接種で免疫し、強毒
SCHU P9 株を経気道感染させても致死的感染を防御した。これらの結果から、ヒトにおいても
ΔpdpC を皮下接種で免疫することにより野兎病菌の発症防御が可能であると考えられ、ΔpdpC
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は安全で有効な生ワクチン株であると考えられた。 
 


マウスおよびサルモデルを用いた野兎病菌 Francisella tularensis ΔpdpC変異株の弱毒生ワクチンとしての有用性の評価

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マウスおよびサルモデルを用いた野兎病菌 Francisella tularensis ΔpdpC変異株の弱毒生ワクチンとしての有用性の評価

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