Production de protéines recombinantes chez la levure Yarrowia lipolytica

Abstract

Les protéines recombinantes (rProt) revêtent une importance capitale (comme produit fini et comme catalyseur) dans les domaines de la pharmaceutique, de la chimie, des cosmétiques, de l'alimentation humaine et animale, et du traitement des déchets. Pour des raisons de qualité, une partie de ces protéines est produite par des systèmes-hôtes levuriens, tels Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris (syn. Komagataella sp.). Outre ces hôtes établis, la levure non-conventionnelle Yarrowia lipolytica représente une usine cellulaire prometteuse pour la production de rProt. En effet, Y. lipolytica synthétise et sécrète des protéines de manière substantielle, jusqu’à 1–2 g·L-1. De plus, certains des inconvénients inhérents à ses prédécesseurs (hyperglycosylation élevée, effet Crabtree, dépendance au méthanol pour induire l'expression hétérologue) sont absents chez Y. lipolytica. Néanmoins, un manque de vue d'ensemble et d'outils spécifiques pour répondre aux exigences de cette levure l’empêchent toujours d'atteindre son plein potentiel de production de rProt. Dans le cadre de cette thèse, deux problèmes majeurs de la production de rProt chez Y. lipolytica ont été sélectionnés et traités : l’absence de promoteurs inductibles pratiques et la difficulté à maîtriser le dimorphisme au cours des processus en bioréacteur. Ces deux problèmes d’ordre pratique ont été résolus suite à la découverte et au détournement d’un gène de sa fonction primaire. Dans un premier temps, l'identification et la caractérisation du gène EYK1 dans le cadre du métabolisme de l'érythritol et de l'érythrulose chez Y. lipolytica ont conduit au développement de promoteurs régulés par ces polyols. Leur facilité d'utilisation et leur polyvalence se révèlent correspondre aux critères de production d'une large gamme de rProt. En utilisant une souche-hôte et des plasmides adaptés à l'expression inductible par l'érythritol et l'érythrulose, environ 45 000 U·mL-1 de lipase CalB sécrétée – le rendement le plus élevé jamais atteint chez la levure – ont été obtenus en 24 h dans un bioréacteur planctonique en mode batch. Deuxièmement, la découverte du gène YlHsl1 a permis d’obtenir des cellules mutantes bloquées dans une morphologie pseudohyphale (ne pouvant plus changer de conformation en réponse à des stimuli environnementaux). Ces cellules s’adaptent parfaitement à la croissance à l’état immobilisé au sein du bioréacteur, ce qui constitue un atout supplémentaire pour les bioprocédés continus et simplifie le traitement en aval des protéines sécrétées. Enfin, le système d'expression induit par l'érythritol développé pour Y. lipolytica au cours de cette thèse a été directement comparé pour la première fois à celui de P. pastoris, pour leur capacité à produire des rProt (ici la lipase CalB). La comparaison a révélé un titre de lipase CalB sécrétée 5 fois plus élevé dans les cultures en bioréacteur de Y. lipolytica que dans celles de P. pastoris, confirmant l'efficacité de Y. lipolytica pour la production de rProt