Generación y caracterización de nuevos modelos celulares asociados al deficit neural en IGF-1

Abstract

Resumen del póster presentado al 42nd Congress of the Spanish Society of Biochemistry and Molecular Biology (SEBBM), celebrado en Madrid del 16 al 19 de julio de 2019.La deficiencia humana del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1) causa una enfermedad rara (ORPHA 73272) que cursa con retraso en el crecimiento, microcefalia y sordera neurosensorial. El modelo murino deficiente en Igf1 reproduce el mismo síndrome y presenta una incorrecta diferenciación neuronal del ganglio auditivo acompañada de apoptosis temprana de las neuronas auditivas. El estudio del papel protector que ejerce el IGF-1 frente a la pérdida auditiva es complicado por la heterogeneidad celular de la cóclea y la limitación de los modelos experimentales disponibles. Como consecuencia, se ha generado un modelo celular de la enfermedad humana en la línea de neuroblastoma murino Neuro2a mediante edición génica con CRISPR/Cas9. Dicho modelo reproduce la deleción parcial del exón 3 del gen Igf1 murino descrita como causante de pérdida auditiva en el hombre. Para la edición génica se transfectó el complejo crRNA:tracrRNA:Cas9 en forma de ribonucleoproteína y se comprobó su incorporación en las células mediante microscopía detectando el tracrRNA marcado fluorescentemente. La presencia de mutaciones se evaluó mediante Surveyor y se seleccionaron las células mutadas tras clonación por dilución límite. La edición del gen Igf1 se comprobó por PCR en 56 clones y 5 de ellos se secuenciaron mediante el méetodo Sanger, confirmándose la deleción parcial de Igf1 en dos de los clones. Para el resto se emplearía la herramienta Mosaic Finder, desarrollada in-house, que permite analizar la multiplicidad alélica generada tras la edición genética mediante next-generation sequencing (NGS) y posterior análisis bioinformático. Finalmente, se ha iniciado un estudio del estado neuroinflamatorio de los clones secuenciados y de su respuesta a distintos estímulos pro-inflamatorios, que puede contribuir a desvelar algunos mecanismos moleculares asociados a la deficiencia crónica de IGF-1.Agradecimientos: ACCI2016 (ER16P5AC7091); ACCI2017 (ER17P5AC7611) y ACCI2018 (ER19P5AC761).Peer reviewe