La presente invención se refiere a un método de detección simultánea de ADN de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis mediante la técnica de PCR multiplex cuantitativa en tiempo real, basada en sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes. Esta técnica es aplicable tanto en muestras biológicas como en cultivos microbiológicos y muestras ambientales. Además, otro aspecto de la invención es un kit que permite detectar los dos microorganismos de forma simultánea.REIVINDICACIONES: 1. Método para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende:
a. obtener una muestra y aislar su ADN,
b. amplificar un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis contenido en el ADN aislado en el paso (a) ,
c. determinar la desviación del paso (b) con respecto a los controles y
d. analizar la desviación del paso (c) y atribuir la misma a la presencia de los citados microorganismos.
2. Método según la reivindicación 1 donde la concentración del ADN aislado para llevar a cabo la amplificación es de al menos 10 fg/μl.
3. Método según la reivindicación 1 donde la muestra es:
a. una muestra biológica,
b. un cultivo microbiológico o
c. una muestra ambiental.
4. Método según la reivindicación 3 donde la muestra biológica está relacionada con el aparato respiratorio.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la amplificación de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y la amplificación de la región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis se realiza por medio de los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real caracterizada porque se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
7. Método según la reivindicación 6 donde las sondas son:
a. SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y
b. SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
8. Método según la reivindicación 7 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.
10. Kit para la detección simultánea de Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis que comprende pares de cebadores que pueden amplificar, mediante la técnica de la PCR, un fragmento de la región ITS del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y/o Paracoccidioides brasiliensis.
11. Kit según la reivindicación 10 que comprende los cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para amplificar un fragmento de la región ITS2 del ADN ribosómico de Histoplasma capsulatum y los cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 para amplificar un fragmento de la región ITS1 del ADN ribosómico de Paracoccidioides brasiliensis.
12. Kit según la cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde la amplificación se realiza por medio de PCR multiplex en tiempo real y se emplean sondas específicas marcadas con dos fluoróforos diferentes.
13. Kit según la reivindicación 12 donde las sondas son:
a. SEQ ID NO: 3 para el fragmento amplificado de Histoplasma capsulatum y se marca en el extremo 5'con un fluoróforo y en el extremo 3' con un quencher y
b. SEQ ID NO: 6 para el fragmento amplificado de Paracoccidioides brasiliensis y se marca en el extremo 5' con un fluoróforo distinto del usado en el apartado (a) y en el extremo 3' con un quencher.
14. Kit según la reivindicación 13 donde el fluoróforo del apartado (a) es FAM, el fluoróforo del apartado (b) es HEX y el quencher es BHQ1.
15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para el diagnóstico de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis en una muestra biológica, ambiental o en un cultivo microbiológico.
16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, para la monitorización de la respuesta a un tratamiento de histoplasmosis y/o paracoccidioidomicosis.Cuando una patente se hace internacional, se puede encontrar en el idioma de cada país en que se ha solicitado. En Espacenet se tiene acceso a los documentos en cada idioma.Instituto de Salud Carlos IIISolicitud de patent
