During the period March 2003 – May 2004 at the Laboratory of Clinical Microbiology “Redaelli” LTCRF in Milan,
Italy, a total of 529 E. coli, obtained from inpatients of 3 different Long Term Care Rehabilitation Facilities
(LTCRFs) in Northern Italy, were processed and 77 ESßLs producers (14.5%) were identified by Vitek System.
The results were confirmed by double-disk synergy test with tazobactam (TZP). 61/77 isolates were characterized
by higher levels of resistance to cefotaxime (CTX) than to ceftazidime (CAZ). (ß-lactamase production was
investigated by analytical isoelectric focusing (IEF) coupled with a bioassay and showed multiple (ß-lactamase
bands including one enzyme with pI 8.4 that, in a bioassay, was more active on CTX,ATM than on CAZ. The
presence of (ß-lactamase genes was investigated by colony blot hybridization and by PCR amplification of
blaTEM, blaSHV and blaCTX-M alleles. 43/61 isolates produced both TEM-1 and CTX-M-type enzymes, 14/61
expressed only CTX-M-type while in 4 cases were found blaCTX-M, blaTEM and blaSHV genes.The remainders
(16/77), characterized by high levels of resistance to both CTX and CAZ, produced TEM-1 and SHV-5 enzymes
(1/16) and TEM type ESßLs (15/16). Conjugation experiments, performed in liquid medium, confermed that the
ESßLs determinants were transferable. Pulsed-field gel electrophoresis profiles of genomic DNA, digested with
NotI, were analysed and revealed clonal heterogeneity.
Our work confirms the emergence of CTX-M-type enzymes and their spread in Northern Italy also in longterm
care and rehabilitation facilities that may be an important reservoir of ES?L producing E. coli

Cristina Terulla

Elisabetta Nucleo

Fabiola Martino

Laura Pagani

Melissa Spalla

Michela Balzaretti

Roberta Migliavacca

NUCLEO, ELISABETTA

MIGLIAVACCA, ROBERTA

SPALLA, MELISSA

PAGANI, LAURA

Archivio Istituzionale della Ricerca - Università degli Studi di Pavia

139MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (3), 2008 DIFFUSIONE DI E. COLI CTX-M PRODUTTORI IN LTCRF DEL NORD ITALIAINTRODUZIONELa produzione di Extended-Spectrum β-lattamasi(ESßLs) negli enterobatteri, rappresenta un pro-blema di rilevante impatto clinico ed epidemiolo-gico che, recentemente, si è esteso anche allestrutture di lungodegenza riabilitativa (LTCRF)ed alle case di cura per anziani (9, 12, 2).In queste strutture, che accolgono una popolazio-ne caratterizzata da numerosi fattori di rischiopredisponenti all’acquisizione di infezioni noso-comiali, è spesso necessario ricorrere a terapieantibiotiche intense e prolungate che favorisconola selezione dei determinanti di resistenza.La somministrazione indiscriminata di cefalospo-rine a spettro allargato è una pratica ricorrenteall’interno di queste strutture, in cui vengono iso-lati frequentemente microrganismi produttori diESßL spesso caratterizzati da una diffusione ditipo epidemico. Il numero considerevole dipazienti sovente spostati tra diverse unità di curaalimenta, inoltre, la diffusione di tali resistenze ene rende più difficile il controllo.Nelle Enterobacteriaceae stanno emergendoESßL di tipo CTX-M, enzimi la cui diffusione, siatra batteri appartenenti a specie diverse che in dif-ferenti parti del mondo, dal 1995 ad oggi, è indrammatico aumento (4).La prima ESßL di tipo CTX-M (FEC-1) è stataSpread of CTX-M-type ESßLs in isolates of E. colifrom long-term care and rehabilitation facilities inNorthern ItalyElisabetta Nucleo1, Roberta Migliavacca1, Michela Balzaretti2, Fabiola Martino1,Melissa Spalla3, Cristina Terulla3, Laura Pagani11Università di Pavia,2Laboratorio di Microbiologia ASP Piero Redaelli, Milano,3Laboratorio di Microbiologia IRCCS S. Matteo, PaviaKey words: CTX-M, E. coli, LTCRF, epidemic diffusionDiffusione di Extended-Spectrum-ß-Lattamasi di tipo CTX-M in isolati clinici di E. coli provenien-ti da strutture di lungodegenza e riabilitazione geriatriche del Nord ItaliaSUMMARYDuring the period March 2003 – May 2004 at the Laboratory of Clinical Microbiology “Redaelli” LTCRF in Milan,Italy, a total of 529 E. coli, obtained from inpatients of 3 different Long Term Care Rehabilitation Facilities(LTCRFs) in Northern Italy, were processed and 77 ESßLs producers (14.5%) were identified by Vitek System.The results were confirmed by double-disk synergy test with tazobactam (TZP). 61/77 isolates were character-ized by higher levels of resistance to cefotaxime (CTX) than to ceftazidime (CAZ). (ß-lactamase production wasinvestigated by analytical isoelectric focusing (IEF) coupled with a bioassay and showed multiple (ß-lactamasebands including one enzyme with pI 8.4 that, in a bioassay, was more active on CTX, ATM than on CAZ.Thepresence of (ß-lactamase genes was investigated by colony blot hybridization and by PCR amplification ofblaTEM, blaSHV and blaCTX-M alleles. 43/61 isolates produced both TEM-1 and CTX-M-type enzymes, 14/61expressed only CTX-M-type while in 4 cases were found blaCTX-M, blaTEM and blaSHV genes.The remainders(16/77), characterized by high levels of resistance to both CTX and CAZ, produced TEM-1 and SHV-5 enzymes(1/16) and TEM type ESßLs (15/16). Conjugation experiments, performed in liquid medium, confermed that theESßLs determinants were transferable. Pulsed-field gel electrophoresis profiles of genomic DNA, digested withNotI, were analysed and revealed clonal heterogeneity.Our work confirms the emergence of CTX-M-type enzymes and their spread in Northern Italy also in long-term care and rehabilitation facilities that may be an important reservoir of ES?L producing E. coli.Received June 8, 2006 Accepted April 16, 2008F U L L  PA P E R SCorresponding author: Laura PaganiVia Brambilla 74, 27100 PaviaTel.: 0382 5484206 - Fax: 0382 5484255 - E-mail: lpagani@unipv.itsegnalata agli inizi degli anni ’80. Gli enzimi ditipo CTX-M rappresentano un gruppo di ß-latta-masi a spettro esteso di classe A plasmide media-te. Humeniuk, et al. hanno identificato come pro-genitore delle ESßL di tipo CTX-M l’enzima cro-mosomico AmpC di Kluyvera ascorbata, un bat-terio enterico di raro riscontro clinico (1). Glienzimi di tipo CTX-M sono caratterizzati da unamaggiore attività idrolitica verso il cefotaxime(CTX), da cui il nome CTX-M, ed il ceftriaxone,piuttosto che verso il ceftazidime (CAZ); mostra-no una maggiore sensibilità al tazobactam (TZP)rispetto al clavulanato (11). Il rapido sviluppodella famiglia CTX-M ha coinvolto diverse speciedi Enterobacteriaceae diffuse per lo più in trearee geografiche: Sud America, Europa edEstremo Oriente. Recentemente sono state segna-late anche in Italia (6, 7). I geni blaCTX-M pos-sono essere localizzati a livello cromosomico, mamolto spesso vengono identificati a livello pla-smidico (11).Scopo del lavoro è stato studiare la diffusione diE. coli produttori di ESßL di tipo CTX-M in trestrutture di lungodegenza riabilitativa geriatriche(LTCRFs) del Nord Italia.MATERIALI E METODIStipiti battericiNel periodo marzo 2003 - maggio 2004 sono statiraccolti, da urine di pazienti con catetere vescica-le ricoverati in diverse LTCRF del Nord Italia, 77isolati clinici di E. coli consecutivi e non replica-ti con fenotipo di resistenza suggestivo della pro-duzione di ESßL. Test di sensibilitàLa sensibilità agli antibiotici e la produzione diESßL sono state valutate in un primo tempomediante GNS CARD (Vitek System, bioMérieux).La produzione di ESßL è stata poi confermata tra-mite test del doppio disco.Tale test è stato eseguito su Mueller-Hinton(MH) agar ponendo, dopo semina a confluen-za di una sospensione batterica avente torbidi-tà pari a 0.5 McFarland, dischetti di FEP,CAZ, CTX, ed ATM ad una distanza di 25 mmcentro-centro da uno di TZP. La positività altest è stata attribuita sulla base della presenzadi evidenti distorsioni degli aloni di inibizioneverso il dischetto centrale (effetto sinergico).Caratterizzazione delle β-lattamasiDa ogni ceppo in esame sono stati ottenuti estrat-ti enzimatici grezzi. Le colture in fase logaritmicadi crescita sono state centrifugate e le cellule,lavate con tampone sodio-fosfato 10 mM (pH7.0), sono state sottoposte a sonicazione.L’estratto enzimatico grezzo ottenuto è stato quin-di sottoposto ad isoelettrofocalizzazione (IEF) ingel di poliacrilamide anfolinizzato. Le bande ß-lattamasiche sono state visualizzate utilizzandouna cefalosporina cromogena (nitrocefin). Il pro-filo di attività sui substrati delle bande beta-latta-masiche ottenute è stato determinato tramite sag-gio biologico: dopo IEF il gel è stato ricopertocon un sottile strato di MH agar addizionato di1µg/ml dello specifico antibiotico da valutare.Dopo due ore di incubazione a 37°C, sull’agarcontenente antibiotico è stata seminata a con-fluenza una brodocoltura cresciuta overnight di E.coli ATCC 25922 (108 UFC/ml). La crescita di E.coli ATCC 25922, sensibile alla concentrazione diantibiotico presente nel terreno, può avvenire erisulta visibilmente evidente solo in corrispon-denza delle bande enzimatiche al cui livello ilsubstrato in esame viene idrolizzato. In assenza diidrolisi la crescita batterica risulta inibita.Esperimenti di coniugazioneIl trasferimento dei determinanti di resistenza èstato ottenuto in terreno liquido usando comerecettori E. coli K12 J53-2 met-, pro-, rif r e J62pro-, his-, trp-, lac-, smr. I batteri transconiugantisono stati selezionati in McConkey agar, addizio-nato di rifampicina (100 mg/l) o streptomicina(1000 mg/l) e cefotaxime (2 mg/l).Analisi del DNA plasmidicoIl DNA plasmidico è stato estratto e purificatomediante lisi alcalina. Gli estratti di DNA plasmi-dico sono stati successivamente sottoposti a dige-stione enzimatica con EcoRI e quindi valutati peril profilo di restrizione.Ricerca dei geni blaTEM, blaSHV e blaCTX-MLa ricerca dei determinanti di resistenza blaTEM,blaSHV e blaCTX-M, è stata eseguita mediante la tec-nica dell’ibridazione su colonia e l’amplificazio-ne genica (PCR). L’ibridazione su colonia è stataeseguita su filtri di nitrocellulosa sterili posti inpiastre di MH agar. Le sonde di ibridazione sonostate sintetizzate usando il kit “ECL Random-prime direct nucleic acid labelling and detectionsystem” (Amersham Biosciences). La rivelazionedel segnale di chemiluminescenza è stata ottenutaa seguito di esposizione ad una lastra autoradio-grafica. Le sonde utilizzata per l’esperimento diibridazione sono state costruite sulla base dei geniblaTEM, blaSHV e blaCTX-M e con i seguenti primer:TEM/F- ATA AAA TTC TTG AAG AC e TEM/R- TTA CCA ATG CTT AAT C; SHV/F- GCCCGG GTT ATT CTT ATT TGT CGC e SHV/R -TCT TTC CGA TGC CGC CGC CAG TCA;CTX-M-3/F- AT GGT TAAAAAATC ACT GCGCCA G e CTX-M-3/R- TTA CAA ACC GTCGGT GAC GAT TTT. Le stesse sequenze oligo-nucleotidiche sono state impiegate anche perl’amplificazione, tranne che nel caso dei determi-MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (3), 2008 NUCLEO E, MIGLIAVACCA R, BALZARETTI M, et al140141nanti di tipo CTX-M, per i quali è stata utilizzataa tale scopo la coppia di primer: CTX-MU1 5’-ATGTGCAGYACCAGTAARGT-3’e CTX-MU23’-AGACCASTGRATRAARTGGGT-5’.Per entrambi gli esperimenti sono stati inclusi:come controllo negativo E. coli ATCC 25922, ecome controlli positivi ceppi di riferimento pro-duttori degli enzimi TEM-9, SHV-5 e di tipoCTX-M.Tipizzazione molecolare tramite PFGE (PulsedField Gel Electrophoresis)Gli isolati di E. coli sono stati tipizzati a livellomolecolare utilizzando il kit di reagenti n°2 GenePath (Bio-Rad). Il taglio di restrizione del DNAgenomico ottenuto è stato realizzato mediantel’endonucleasi di restrizione NotI. I campionisono stati sottoposti ad elettroforesi in campo pul-sato utilizzando l’apparato GenePath Bio-Rad. Lerelazioni clonali sono state interpretate secondo icriteri proposti da Tenover, et al (10).RISULTATIDurante il periodo Marzo 2003–Maggio 2004sono stati raccolti, presso il Laboratorio diMicrobiologia Clinica dell’ASP “PieroRedaelli” di Milano, un totale di 529 campioniclinici di E. coli. Tutti i campioni provenivanoda urine di pazienti portatori di catetere vescica-le. 77/529 (14.5%) isolati sono risultati ESßLproduttori sia mediante metodo automatizzato(Vitek System) che con il test del doppio disco.Gli ESßL produttori risultavano sempre multire-sistenti, ma sensibili all’associazione piperacil-lina/tazobactam. 61/77 (79.22%) isolati di E.coli ESßL positivi erano caratterizzati da più altilivelli di resistenza al CTX che al CAZ. L’IEFha rivelato la presenza di bande ß-lattamasichemultiple tra cui quella corrispondente ad unenzima con pI 8.4 che, con il saggio biologico,mostrava un’attività maggiore verso il CTX el’ATM che verso il CAZ (figura I).L’ibridazione su colonia effettuata per lo scree-ning dei determinanti di resistenza di tipo CTX-M, ha prodotto risultati positivi per tutti i 61isolati. Gli esperimenti di PCR, eseguiti su partedei 61 isolati positivi all’ibridazione, hannoconfermato la specificità del metodo di scree-ning, fornendo un prodotto di amplificazionedelle dimensioni attese (∼593 bp). L’ibridazionesu colonia è stata effettuata, su tutti i ceppiCTX-M produttori, anche per la ricerca deideterminanti blaTEM e blaSHV. I risultati hannoindicato che 9/61 ceppi esprimevano una sola ß-lattamasi di tipo CTX-M mentre 52/61 isolatipresentavano bande ß-lattamasiche multiple.Più precisamente, 29/52 isolati producevanocontemporaneamente enzimi di tipo CTX-M eTEM-1, 7/52 esprimevano enzimi di tipo CTX-M ed SHV ed, infine, in 16/52 casi erano rileva-bili geni blaCTX-M, blaTEM e blaSHV. Nei restanti16/77 ceppi, caratterizzati fenotipicamente daalti livelli di resistenza sia al CTX che al CAZ,15 erano produttori di una ESßL di tipo TEM,mentre un solo campione era produttore di unaTEM-1 e di una SHV-5. La produzione di ß-lat-tamasi di tipo CTX-M è risultata essere media-ta, in 21/61 casi, da plasmidi coniugativi. L’analisi dei pattern di restrizione ottenuti conPFGE degli isolati CTX-M produttori ha rivela-to eterogeneità clonale, con quattro linee mag-giori (A-D) ed un cluster epidemico specificoper ogni struttura (figura II). I cloni A e B,responsabili di due distinti eventi epidemici indue strutture differenti, sono stati ritrovati anchecoesistere all’interno di una stessa LTCRF(tabella 1). Allo stesso modo il clone (D) è statorilevato in due differenti LTCRF, in una dellequali era presente, contemporaneamente il cloneC. Nei ceppi CTX-M produttori sono stati evi-denziati plasmidi coniugativi di dimensioni(comprese tra le tra le 50 e le 55Kb) e profilo direstrizione differenti, anche nell’ambito di unmedesimo pulsotipo.MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (3), 2008 DIFFUSIONE DI E. COLI CTX-M PRODUTTORI IN LTCRF DEL NORD ITALIAFigura I. Utilizzo della tecnica del substrato ricoprente per larivelazione dell’attività idrolitica di estratti enzimatici grezzi di E.coli verso il cefotaxime.Linee da 1 a 6: Ceppi ST225 con pI 8.4, SHV-5 con pI 8.2, DON130 con pI 8.4, BE 117 con pI 8.3,TM215 con pI 8.0 e DVA10con pI 8.4 e 8.0.CONCLUSIONINell’ambito del la  vasta  famigl ia  del leEnterobacteriaceae, la resistenza mediata dalleß-lattamasi ad ampio spettro di classe A rappre-senta ormai un problema di crescente impatto cli-nico anche in Italia (5, 8). Tra le ESßL di classe A,gli enzimi di tipo CTX-M, in particolare, stannodiffondendosi rapidamente; in Italia tali enzimierano stati fino ad ora riscontrati solo raramentein ambito nosocomiale e comunitario (3, 7). Irisultati ottenuti mostrano, tuttavia, come le strut-ture geriatriche di riabilitazione e di lungodegen-za, rappresentino un reservoir di E. coli CTX-Mproduttori. La diffusione dei geni blaCTX-M negli E.coli isolati è risultata essere sia plasmide - checlone- mediata. Pertanto, la diffusione di questigeni di resistenza, sembra destinata, sul territorionazionale, ad aumentare. Sarebbe auspicabile,perciò, per arginare il problema della diffusione dienterobatteri ESßL-produttori, l’attuazione di unmaggior numero di efficaci misure di controllo.Tali accorgimenti potrebbero consistere nel moni-toraggio dei pazienti al ricovero nonché del con-trollo periodico dei portatori di cateteri vescicalipotenzialmente colonizzati o infettati da micror-ganismi antibiotico-resistenti.MICROBIOLOGIA MEDICA, Vol. 23 (3), 2008 NUCLEO E, MIGLIAVACCA R, BALZARETTI M, et al142Figura II. Profili PFGE (Not I) delle quattro maggiori linee clonali,relative agli isolati clinici di E.coli CTX-M produttori.Linee da 1 a 4: profili A (ceppo DAG120), B (ceppo LG212),C (ceppo ST225), D (ceppo MR204), rispettivamente.Tabella 1. Diffusione di cloni di E. coli CTX-M produttori nelle tre strutture di lungodegenza riabilitativa geriatricheIstituto Golgi Ospedale geriatrico Redaelli Ospedale geriatrico Redaelli(Abbiategrasso) (Vimodrone) (Milano)Pulsotipi D, B, *C *A, B, *D *Bed altri sporadici  ed altri sporadici  ed altri sporadici *clone responsabile di un evento epidemico all'interno della struttura ospedaliera.BIBLIOGRAFIA1. Bonnet R. Growing Group of Extended-Spectrum ß-Lactamases: the CTX-M Enzymes. AntimicrobAgents Chemother 2004; 48: 1-14.2. Bradford PA, Cherubin CE, Idemyor V, RasmussenBA, Bush K. Multiply resistant Klebsiella pneumo-niae strains from two Chicago Hospitals: identifica-tion of the extended-spectrum TEM-12 and TEM-10ceftazidime-hydrolyzing ß-lactamases in a single iso-late. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 761-6.3. Brigante G, Luzzaro F, Perilli M, et al. Evolution ofCTX-M-type beta-lactamases in isolates ofEscherichia coli infecting hospital and communitypatients. 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Diffusione di Extended-Spectrum-ß-Lattamasi di tipo CTX-M in isolati clinici di E. coli provenienti da strutture di lungodegenza e riabilitazione geriatriche del Nord Italia

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