Weisshaar B, Saedler H. Freier Zugang zu genetischen Pflanzenressourcen. GenomXPress. 2005;2005(3):7-9.Die im Rahmen der deutschen Pflanzengenom-Initiative GABI (Genomanalyse im biologischen System Pflanze) am Kölner Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung erstellten GABI-Kat-Linien werden an ein internationales Zentrum für pflanzliche Ressourcen übergeben und damit weltweit frei zugänglich gemacht. Bei den GABI-Kat-Linien handelt es sich um eine Sammlung genau definierter und katalogisierter Gendefekt-Mutanten der Referenzpflanze Arabidopsis thaliana. Das Studium der GABI-Kat-Linien führt Wissenschaftler zur Funktion der jeweils betroffenen Gene und deren Beitrag zu wichtigen pflanzlichen Eigenschaften. In Kulturpflanzen kann damit genau und schnell nach besseren Varianten wichtiger Gene gesucht werden, um so neue Pflanzensorten zu züchten, die z. B. Pilzattacken abwehren, Dürre und Frost widerstehen oder höhere Erträge bei geringerer Düngung liefern

Saedler, Heinz

Weisshaar, Bernd 

Publications at Bielefeld University

7 ForschungDie im Rahmen der deutschen Pflanzenge-nom-Initiative GABI (Genomanalyse imbiologischen System Pflanze) am KölnerMax-Planck-Institut für Züchtungsfor-schung erstellten GABI-Kat-Linien werdenan ein internationales Zentrum für pflanz-liche Ressourcen übergeben und damitweltweit frei zugänglich gemacht. Bei denGABI-Kat-Linien handelt es sich um eineSammlung genau definierter und katalo-gisierter Gendefekt-Mutanten der Refe-renzpflanze Arabidopsis thaliana. Das Stu-dium der GABI-Kat-Linien führt Wissen-schaftler zur Funktion der jeweils be-troffenen Gene und deren Beitrag zuwichtigen pflanzlichen Eigenschaften. InKulturpflanzen kann damit genau undschnell nach besseren Varianten wichtigerGene gesucht werden, um so neue Pflan-zensorten zu züchten, die z. B. Pilzattackenabwehren, Dürre und Frost widerstehenoder höhere Erträge bei geringerer Dün-gung liefern.In höheren Pflanzen ist die gezielte Ver-änderung von bestimmten Genen durch homo-loge Rekombination, wie sie in Hefe- oderMauszellen möglich ist, nicht durchführbar.Deshalb sind große Sammlungen von Inserti-onsmutanten, in denen die betroffenen Genedurch Sequenzierung der Insertionsstellenidentifiziert wurden, von zentraler Bedeutungfür den Fortschritt der Pflanzengenomfor-schung. Wir haben mit Ackerschmalwand (Ara-bidopsis thaliana) gearbeitet, einer weltweitverwendeten Referenzpflanze, deren Erbinfor-mation vollständig entschlüsselt ist. Laut deraktuellen Version der A. thaliana Genomanno-tation (TIGR Ath genome annotation v5, siehehttp://www.tigr.org/tdb/e2k1/aht1.shtml), be-läuft sich die Zahl der proteinkodierenden Geneeinschließlich der Pseudogene auf ungefähr30.700. Die Gesamtzahl der verschiedenenGene, für die zumindest ein Insertionsallel inden verschiedenen öffentlich verfügbaren Res-sourcen aufgeführt ist, beläuft sich auf unge-fähr 27.760.Mit einem aus dem BodenbakteriumAgrobacterium tumefaciens stammenden, na-türlichen System zur Genübertragung konntenwir für 16.900 der insgesamt 26.000 norma-lerweise intakten A. thaliana-Gene zum Teilmehrere unterschiedliche “Knock-out”-Mutan-ten erzeugen. T-DNA-Insertionsmutanten kön-nen in A. thaliana leicht hergestellt werden. T-DNA erzeugt eine geringe Anzahl an mutiertenLoci pro Pflanze und die T-DNA-Markierungkann leicht und direkt mittels PCR nachgewie-sen werden. Die für den Umgang mit T-DNA-Insertionsmutanten notwendige Genetik isteinfach, insbesondere im Vergleich zur Verwen-dung von autonomen Transposons oder Zwei-Komponenten-Transposon-Systemen als Inser-tionsmutagen. Von der internationalen For-schergemeinschaft wurden mehrere T-DNAFreier Zugang zu genetischen Pflanzenressourcen Eine der weltweit größten Sammlungenpflanzlicher “Knock-out”-Linien wird frei zugänglich.Bernd Weisshaar und Heinz SaedlerDefinition von “Gen-Treffern” (gene hits) bei GABI-KatBlick in das Samenlager von GABI-KatForschung 8GenomXPress 2/05mutagenisierte Populationen generiert und dieInsertionsstellen der T-DNA relativ zu denbetroffenen Genen in FST-Datenbanken (flan-kierender Sequenzbereich: Flanking SequenceTags – FST) katalogisiert. Die so erzeugtenInsertionsmutanten sind die Basis für dieBestimmung der Funktionen der ca. 26.000Gene des A. thaliana-Genoms, die nicht alsPseudogene betrachtet werden.Europas größte RessourceNach der Erzeugung wurden die einzel-nen Mutanten zu Pflanzenlinien vermehrt unddas jeweils betroffene Gen mittels PCR-Metho-den und DNA-Sequenzierung identifiziert. Ausden erhaltenen FST-Daten wurde ein “Online-Katalog” erstellt, der es erlaubt, für jedes ge-wünschte Gen die zugehörigen "Knock-out"-Pflanzenlinien zu bestellen. Bisher wurden aufdiese Weise 63.000 Linien entwickelt und kata-logisiert. Die GABI-Kat-Sammlung stellt damitdie weltweit zweitgrößte Ressource für derarti-ge Pflanzenlinien dar (siehe Tabelle “GABI-Katin Zahlen”). Die größte derartige Sammlung istdie SALK T-DNA-Insertionsmutanten-Populati-on, die 145.589 lokalisierte Insertionen enthältund damit 21.784 verschiedene Gene abdeckt(siehe http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaex-press). Die GABI-Kat FST-Daten sind in EMBL-Bank/GenBank eingestellt und werden überdas Internet mittels einer Webseite mit Such-maske (http://www.gabi-kat.de/) verfügbargemacht. Außerdem steht der vollständigeDatensatz als Download-Datei für die Integra-tion in andere Datenbanken wie SIGnAL(http://signal.salk.edu/) oder FLAGdb++(http://urgv.evry.inra.fr/projects/FLAGdb++/HTML/index.shtml) zur Verfügung.Eine Insertionsmutante für jedes Gen? Auf den ersten Blick scheint die Ab-deckung aller Arabidopsisgene durch die  welt-weit in Datenbanken gelisteten FSTs bzw. T-DNA-Insertionslinien recht gut. Bei der Beurtei-lung der Zahlen muss jedoch beachtet werden,dass die tatsächliche Abdeckung des A. thalia-na-Genoms mit Insertionen sehr von dergenauen Definition eines "zählbaren" Inserti-onsallels abhängig ist. Die GABI-Kat Webseite(http://www.gabi-kat.de) führt in der Daten-bank-Ausgabe Nr. 17 (Februar 2005) zum Bei-spiel nur 11.987 Gene auf, in denen die Inser-tionsstelle zwischen den jeweiligen Start- undStopkodons vermutet wird. Wir bezeichnendiese Insertionen als CDSi-Insertionen. DerBegriff "CDSi" weist darauf hin, dass die ent-sprechende Insertion in der kodierendenSequenz oder in den Introns zwischen dem ers-ten und dem letzten proteinkodierenden Exonlokalisiert ist (siehe Abb. S. 7). Weil bei diesenInsertionen das kodierte Protein verändert ist,und/oder eine Störung der Transkriptreifung vor-liegen sollte, führen solche Insertionen zu dras-tischeren Effekten als Insertionen außerhalb die-ser Region.Die als "selling number" verwendbareZahl der durch Insertionen abgedeckten Genewird durch diese Definition, die sich auf wahr-scheinlich brauchbare Insertionen beschränkt,deutlich von 16.664 auf 11.987 reduziert. Eskommt hinzu, dass nicht alle Insertionen, dieauf Basis der FST-Daten in der EMBL-Bank/GenBank vorausgesagt wurden, in den folgen-den Generationen der Pflanzenlinien wieder zufinden sind. Ein hierzu beitragendes Problemist, dass einige Linien für die T1-Blattmaterialgeerntet wurde und FST-Daten produziert wur-den, keine Samen oder Samen ohne Keimfähig-keit bilden. Informationen über solche "verlo-renen" Linien wurden bereits in die öffentlichzugängliche GABI-Kat Datenbank integriert.Unsere Erfahrungen zeigen auch, dass in derGABI-Kat-Population nur etwa 80% der auf-grund der aus T1-DNA generierten FSTs vor-hergesagten Insertionen bestätigt werden kön-nen. Kollegen, die intensiv mit Insertionsmu-tationslinien aus anderen Quellen arbeiten,beobachten ähnliche Erfolgsquoten. Die Quotekann geringfügig erhöht werden, wenn logisti-sche Fehler, welche die Verknüpfung zwischenFST-Datensatz und Pflanzenlinie beeinflussen,korrigiert werden oder, wenn technische Pro-bleme während des PCR-basierten Bestäti-gungsprozesses gelöst werden. Trotzdem bleibtdie Tatsache bestehen, dass nicht alle vorher-gesagten Insertionen in Form eines mutiertenAllels des gewünschten Gens "materialisiert"werden können. Zusammengefasst können wirfolgern, dass die Abdeckung der Gene im A.thaliana Genom mit wirklich brauchbaren Inser-tionsallelen deutlich geringer ist als auf derBasis der oben zitierten Zahlen erwartet wer-den könnte.Tausende von Anfragen nach GABI-Kat-Linien aus dem In- undAusland liegen vor. Die große Nachfrage ist einBeweis für die hohe Qualität und Zuverlässig-keit der in GABI erstellten Ressource. Insgesamt2.750 Linien wurden bislang an Wissenschaft-ler in aller Welt versandt. Die Anzahl der Publi-kationen, in denen über Ergebnisse berichtetwird, die mit Hilfe von GABI-Kat Linien erarbei-tet wurden, nimmt ständig zu. Um diese um-fangreiche Sammlung dauerhaft für die Wis-senschaft zu erhalten, wurde jetzt mit dem bis2007 dauernden Transfer der GABI-Kat-Linienan das Nottingham Arabidopsis Stock-Center(NASC) begonnen. Das NASC ist die zentraleeuropäische Sicherungs- und Verteilungsein-heit für genetische Ressourcen und befindetsich in Großbritannien (http://www.arabidop-sis.info/). Auf der Basis einer Vereinbarung zwi-schen den Förderpartnern von GABI und derMax-Planck-Gesellschaft (MPG), die im Juni2005 bekannt gegeben wurde, können GABI-Kat-Linien der internationalen Forschungsge-meinde nun auf diesem Weg zur Verfügunggestellt werden. Die neue Vereinbarung zumMaterialtransfer (MTA – material transferagreement) wurde im Juni 2005 bereitgestelltund ist über die GABI-Kat-Webseite erhältlich.Selbstverständlich bleiben alle bisher unter-zeichneten Vereinbarungen in der unterzeich-neten Form gültig.Der Transfer ist gestartetIm Folgenden wird der Transfer der Lini-en an das NASC mit einigen relevanten Detailsbeschrieben. Die GABI-Kat-Linien, die bereitsbestätigt wurden, werden als Gruppen von T3-Samen transferiert. Ein “T3-Set” besteht dabeiaus den T3-Samen einer segregierenden Fami-lie, wobei die Samen von einzelnen T2-Pflanzengetrennt geerntet wurden. Dies ermöglicht denNutzern den direkten Zugriff auf potentiellhomozygotes Material für eine bestimmte In-sertionslinie. Wenigstens eine homozygotePflanze befindet sich mit hoher Wahrschein-lichkeit unter den 12 bis 18 herangezogenenT2-Pflanzen einer Linie. Idealerweise würde dieGenotypisierungsinformation über die jeweili-gen T2-Pflanzen von den Nutzern der Ressour-ce abgefragt und am NASC gesammelt werden,so dass bekannt wird, welche T2-Pflanze homo-zygot und welche heterozygot für die jeweiligeInsertion war.Alle T2-Pflanzen müssen resistentgewesen sein, weil sie auf selektiven Medienherangezogen werden. Dies bedeutet auch,dass es keine überlebenden T2-Pflanzen gebensollte, die homozygot für das in Frage stehendeWildtyp-Allel sind, es sei denn, es existiert einzweiter Lokus, der Resistenz liefert.Der Transfer von bestätigten Linien vonGABI-Kat zum NASC hat im Juni 2005 begon-nen und wird bis zum voraussichtlichen Endedes GABI-Kat-Projektes im Jahr 2007 fortge-9 Forschungsetzt werden. Im August 2005 waren bereitsmehr als 5.000 Samenstocks an das NASC ab-gegeben. Dies entspricht etwa 450 Familienoder “T3-sets”, dem Äquivalent von Originalli-nien. Sobald das NASC diese Linien zur Auf-nahme in die Sammlung aufbereitet hat, wer-den sie für Bestellungen über die NASC Web-seite zur Verfügung stehen – im August 2005sind dies 175 "T3 sets" (2.365 Samenstocks).GABI-Kat wird diese Linien nicht weiter an Userabgeben. Die Vorbereitung der hohen Zahl anT3-Samentütchen und die benötigte Annotati-on und Logistik sind sehr arbeitsintensiv. Wirgehen davon aus, dass wir pro Woche ungefähr1.200 Samentütchen an das NASC schickenkönnen, was einer Abgabe von ca. 100 bestä-tigten Linien pro Woche entspricht.Die GABI-KatWebseite stellt die zusätzlichen Informationenzur Verfügbarkeit von Linien am NASC seitAugust 2005 bereit. Diese Informationen wer-den nach jeder neuen Linienabgabe aktualisiert.Linien, die bereits ans NASC überführtwurden, können beim Stockcenter für eineGebühr von 10 britischen Pfund pro “T3-Set”zzgl. einer Bearbeitungsgebühr von 8,50 briti-schen Pfund pro Bestellung abgerufen werden.Zusätzlich können weiterhin Insertionsliniendirekt bei GABI-Kat bestellt werden. DieseZugangsmöglichkeit sollte sich selbstverständ-lich auf Linien konzentrieren, die noch nichtbestätigt sind und deswegen auch nicht als T3-Samen ans NASC abgegeben werden konnten.Wenn diese Linien bestätigt sind, werden siegegen eine Gebühr von 100 Euro pro Linie undnach Unterzeichnung des o. g. MTAs an denBesteller abgegeben. Die Gebühr beinhaltet dieVerpackungs- und Portokosten. Normalerweiseerhält der Besteller unmittelbar nach der posi-tiven Bestätigung ein Aliquot der T2-Samen derentsprechenden Linie. Wenn jedoch z. B. alleT2-Samen einer Linie zum Anziehen von T2-Pflanzen verwendet wurden, kommt es zu einerVerzögerung bei der Lieferung der Samen bisT3-Samen geerntet wurden.Mehr als 2000 exklusive Genein GABI-Kat Wir haben unseren FST-Datensatz nachCDSi-Insertionsallelen der Gene untersucht, diesoweit bekannt nur durch GABI-Kat abgedecktsind. Wir haben ungefähr 2.100 Gene gefun-den, für die CDSi Insertionen nur bei GABI-Katerhältlich sind. Diese Linien werden nach undnach in die Bestätigungs-Pipeline aufgenom-men und – sofern ohne Verzögerung bei direk-ten Nutzer-Anfragen möglich – abgearbeitet.Nach positivem Ausgang der Bestätigung undim Anschluss an eine Ernte von T3-Samen, wer-den diese Linien ebenfalls wie oben beschrie-ben ans NASC abgegeben, genau wie Linien dieauf Nutzeranfrage hin neu bestätigt werden.Letztlich werden alle bestätigten Linien ansNASC abgegeben, wobei es zwangsläufig zueiner gewissen Verzögerung kommt. Dies istzurückzuführen auf die Dauer der Reifung derT3-Samen, die Vorbereitung der vielen T3-Sa-mentütchen für die Abgabe bei GABI-Kat, undauch den Aufnahmeprozess der neuen Samen-stocks am NASC.Mit der Unterstützung bei Erstellungund Freigabe der GABI-Kat-Linien leisten dasBundesministerium für Bildung und Forschung,die im Wirtschaftsverbund Pflanzengenomfor-schung GABI organisierte deutsche Wirtschaftund die Max-Planck-Gesellschaft einen wichti-gen, viel beachteten Beitrag für die gemeinsa-me weltweite Zusammenarbeit in der Wissen-schaft. Die erleichterten Zugangsbedingungen,die durch die privaten Förderungspartner desGABI Programms möglich gemacht wurden,sollten in einer weiteren, intensiven Nutzungder GABI-Kat-Insertionsmutanten resultieren.Damit leisten sie einen wichtigen Betrag zurstetig zunehmenden Zahl an Pflanzengenen,von deren Funktionen wir wenigstens einegewisse Vorstellung haben.KontaktBernd WeisshaarMPI für Züchtungsforschung, KölnBitte senden Sie Ihre Emails bzgl.GABI-Kat an: info@gabi-kat.deAktuelle Adresse:Universität Bielefeld, Fakultät für Biologie,33594 BielefeldEmail: bernd.weisshaar@uni-bielefeld.deReferenzenGABI-Kat: http://www.gabi-kat.de/SIGnAL T-DNA Express:http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpressTIGR Ath genome annotation:www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/ath1.shtmlNASC: www.arabidopsis.info/GABI Programm: www.gabi.de/MPI für Züchtungsforschung: http://www.mpiz-koeln.mpg.de/WPG: http://www.gabi.de/21seiten/e_06_e.phpGABI-Kat in Zahlen A) Zeitplan01.06.2000: Beginn der Förderung des Projektes01.05.2001: Beginn der Produktionsphase der FST-Generierung01.05.2002: Veröffentlichung des ersten öffentlichen MTA01.05.2002: Erste Großeinreichung von FSTs an EMBL-Bank/GenBank01.06.2002: Eröffnung der SimpleSearch Suchmaschine über Internet01.08.2002: Aktualisierung von SimpleSearch mit graphischen Darstellungen der Insertionsstellen relativ zu Genen15.02.2003: Neue Definition eines „Gen-Treffers”15.09.2004: Re-Annotation aller FSTs anhand des TIGR v5 Genom-Datensatzes (Genomannotation) 13.06.2005: Erste Samenübergabe an das NASC24.06.2005: Veröffentlichung des zweiten öffentlichen MTA (Disclaimer)B) Die Zahlen im August 2005Resistente Linien gekeimt und selektiert: 89.000Linien mit erfolgreicher DNA-Extraktion und T2-Samenernte: 83.000Gesamtzahl der GK FSTs in der EMBL-Bank/GenBank: 106.000Linien mit erfassten „Genomtreffern“: 63.000Zahl der Gene mit mindestens einem „Gen-Treffer“: 16.900Prozentuale Genabdeckung (+/- 300 bp Definition): 64,5%Zahl der Gene mit mindestens einem „CDSi-Treffer“: 12.200Prozentuale CDSi-Abdeckung: 46,1%Insgesamt angefragte Linien: 3.300Bestätigte und verschickte Linien: 2.750

Freier Zugang zu genetischen Pflanzenressourcen

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Freier Zugang zu genetischen Pflanzenressourcen

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