Larisch C. Charakterisierung des Sigmafaktors SigB aus Corynebacterium glutamicum und seiner Rolle bei der Genexpression in der Transitionsphase des Wachstums. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2006.Im Genom von Corynebacterium glutamicum konnten sieben Gene identifiziert werden, die für Sigmafaktoren kodieren. Diese ließen sich in essentielle (SigA), nicht-essentielle (SigB) und alternative Sigmafaktoren (SigC, SigD, SigE, SigH, SigM) unterteilen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der nicht-essentielle Sigmafaktor SigB im Hinblick auf seine Rolle in der globalen Genexpression sowohl bei Antwort auf Stressfaktoren als auch beim Übergang vom exponentiellen Wachstum zur stationären Phase untersucht werden.
Die zunächst durchgeführte Charakterisierung des sigB-Gens mittels Expressionsanalysen zeigte, dass die höchste Expression während des Übergangs von der exponentiellen zur stationären Phase erfolgt. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die sigB-Expression durch Kälte- und Ethanolstress deutlich erhöht wird. Durch eine gezielte Gendeletion im Restriktions- und Modifikations-defekten Stamm RES167 konnte eine sigB-Mutante (C. glutamicum CL1) konstruiert werden, mit deren Hilfe durch Wachstumstests und Lebendtiterbestimmungen gezeigt werden konnte, dass SigB ebenfalls an der Bewältigung von Ethanol- und Kältestress beteiligt ist. Des weiteren konnte durch ein IPTG-induzierbares sigB-Überexpressionsplasmid ein Einfluss von sigB auf das Wachstum gezeigt werden.
Nach der Etablierung einer Glukose-limitierten batch-Fermentation wurde in diesem kontrollierten und Stress-armen System das SigB-Regulon im Wildtyp und in der sigB-Deletionsmutante mittels DNA-Microarray-Hybridisierungen bestimmt. Dabei waren 153 Gene auffällig, deren verstärkte Expression beim Übergang von der exponentiellen zur stationären Phase von der Anwesenheit von sigB abhing. Die Gene dieses Regulationsnetzwerks kodieren für eine Vielzahl von Funktionen im Metabolismus, bei Membranprozessen und der Genregulation. Die verstärkte Expression dieser Gene bereitet die Zelle vermutlich auf die veränderten Verhältnisse vor, die während der Stationärphase in der Zelle auftreten können.
Durch bioinformatische Analysen konnte diesem Regulationsnetzwerk eine Promotor-Konsensussequenz zugeordnet werden, an die die RNA-Polymerase durch SigB binden kann. Für die Gene cg0096, cg1083, cg1417, cg2418, cg3141 und cg3330 konnte diese Promotorsequenz mittels RACE-PCR verifiziert werden. Es lassen sich allerdings keine signifikanten Unterschiede zwischen einer SigB-Promotor-Konsensussequenz und der von SigA-Promotoren feststellen, so dass der nicht-essentielle Sigmafaktor SigB vermutlich eine Unterklasse der SigA-Promotoren erkennt. Es konnte gezeigt werden, dass das Expressionsprofil der kartierten sechs Gene im Stamm RES167 mit dem des sigB-Gens übereinstimmt, wohingegen das Profil dieser Gene in Abwesenheit des sigB-Gens im Stamm CL1 über das Wachstum dem Expressionsprofil des Gens sigA entspricht
