Hansen, Sören

English

In den letzten Jahren wurden einige Point of Care oder Point of Need Tests (POCT / PONT) eingeführt, um eine genaue und schnelle Diagnose direkt im Feld oder in einem Krankheitsausbruch zu ermöglichen. Diese Tests können Entscheidungsträgern helfen, unverzüglich die richtigen Maßnahmen zu ergreifen. Typischerweise identifizieren POCT und PONT das Genom von Pathogenen oder deren immunologischen Fingerabdruck. Klassische immunologische Tests (z.B. ELISA) mangelt es an Spezifität aufgrund einer hohen Antigenhomologie innerhalb des jeweiligen Erreger-Genuses, wie es beispielsweise bei Flaviviren der Fall ist. Die Erkennung pathogener Nukleinsäuren unter Verwendung molekularer Methoden, zum Beispiel der PCR, ist eine Herausforderung, da ein empfindlicher und spezifischer Assay auf Vorwissen über DNA- oder RNA-Sequenzen angewiesen ist. Daher können neuartige Pathogene oder Varianten bekannter Infektionserreger unentdeckt bleiben.
 Um diese Nachteile anzugehen, wurden in der Doktorarbeit drei verschiedene Ansätze gewählt: eine schnelle Methode zur Nukleinsäurenextraktion, meta-genomische Diagnostik und ein Peptid-Microarray. 
 Im Zuge dieser Doktorarbeit wurde ein Protokoll zur schnellen Extraktion von Nukleinsäuren aus Grampositiven Bakterien unter Verwendung einer auf Magnetkügelchen basierenden Probenaufreinigung entwickelt. Die Extraktion wurde innerhalb von 20 Minuten durchgeführt. In Kombination mit der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation wurde eine klinische Sensitivität von 90,9% und eine klinische Spezifität von 100% erreicht.
 Ebenfalls wurde im Verlauf der Arbeit ein Protokoll zur schnellen und im Feld anwendbaren Identifizierung von RNA-Viren zur Ermittlung des Erregers bei einem Ausbruch durch diagnostische Metagenomik erstellt. Dafür wurden eine Multiple Displacement Amplifikation und Nanopore Sequenzierung kombiniert, um eine Probe aus dem Überstand einer ZIKV-Zellkultur zu testen. ZIKV fungiert hier als Modellvirus. Das gesamte Verfahren wurde einschließlich der Probenvorbereitung in weniger als sieben Stunden durchgeführt. Das Vorhandensein von ZIKV-Sequenzen innerhalb der erzeugten Reads wurde durch eine Offline-BLAST-Suche bestimmt. 
 Dazu wurde das Verfahren für die schnelle Serotypisierung des Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV) unter Verwendung von Nanoporensequenzierung und Offline-BLAST-Suche weiterentwickelt. Die Offline-BLAST-Suche war bei der Kategorisierung der sieben FMDV-Serotypen unter Verwendung der P1-Region (Spezifität: 98,3%) äußerst erfolgreich. Das gesamte Genom (24,8%), die Regionen P2 (23,6%) und P3 (21,4%) lieferten hingegen keine zufriedenstellenden Ergebnisse.
 Des Weiteren wurde ein Peptid-Microarray verwendet, um eine Gruppe von Zika-Virus (ZIKV)-spezifischen Antikörpertargets zur Differenzierung zu anderen Flaviviren zu identifizieren. Insgesamt wurden 1643 überlappende Oligopeptide synthetisiert und auf Glasträger gedruckt. Die Oligopeptide decken die gesamten Polyproteine verschiedener ZIKV Stämme aus Afrika, Brasilien, den USA und Französisch-Polynesien ab. Die ZIKV Microarray-Chips wurden eingesetzt, um drei Humanserumpools von Zika-Ausbrüchen in Senegal und Kap Verde, Brasilien, sowie von Übersee-Reisenden, die in die EU zurückkehrten, zu untersuchen. Ebenfalls wurde einen Pool gut beschriebener Seren von Patienten, die Dengue-Fieber, Tick-born Enzephalitis oder eine Infektion mit dem West-Nil-Virus hatten, getestet. Insgesamt wurden dreiundsechzig Antikörpertargets identifiziert, von denen die meisten bisher unbekannt waren. Dreizehn von ihnen könnten als potentiell ZIKV-spezifisch eingestuft werden.
 Die mit dem Peptid-Microarray erzielten Ergebnisse können als eine Reihe von Analysewerkzeugen für die serologische Unterscheidung von ZIKV zu anderen Flaviviren angesehen werden. Andererseits bieten das Protokol zur Probenaufreinigung und die beiden Sequenzierungsprotokolle die Möglichkeit, vor Ort anwendbare diagnostische Metagenomik bereitzustellen, da die Workflows in einem mobilen Kofferlabor durchgeführt werden können.
 Zusammenfassend kann gesagt werden, dass diese Doktorarbeit den Weg für zuverlässige POCT und PONT ebnet und ein Beispiel für Forschung auf einer Ebene darstellt, in der die Gesundheit von Mensch, Tier und Umwelt von Bedeutung ist. In recent years, Point of Care (POCT) or Point of Need tests (PONT) have been
established in order to provide accurate and rapid diagnostics directly at field level or
at site of outbreaks. These assays can help decision makers to take the right action
without delay. Typically, POCT and PONT rely on the genomic identification of
pathogens or tracking its immunological fingerprint. Recognition of a pathogen’s
genome in the field using molecular assays highly depends on the efficiency of nucleic
acid extraction. Moreover, the sensitivity and specificity of molecular assays rely on
previous knowledge of DNA or RNA sequences.
Classical immunological based tests i. e. whole antigen based ELISA lack specificity
due to high antigen homology within the respective genus of pathogen as seen, for
instance, in flaviviruses.
To address these drawbacks, this PhD work applied three different approaches: a rapid
nucleic acid extraction method, metagenomic diagnostics and peptide microarray.
During the course of this work a protocol for the rapid extraction of nucleic acids of
Gram-positive bacteria was developed employing magnetic bead based reverse
purification technology. The extraction was carried out within 20 minutes. In
combination with the recombinase polymerase amplification assay, a 90.9 % clinical
sensitivity and 100% clinical specificity were reached.
A protocol for the rapid and field applicable identification of RNA viruses to determine
the causative agent in an outbreak by diagnostic metagenomics was implemented.
Therefore, multiple displacement isothermal amplification and nanopore sequencing
were combined to test a mock sample containing Zika virus (ZIKV). The whole
procedure was conducted in less than seven hours including sample preparation.
Presence of ZIKV sequences within the produced reads was determined by offline
BLAST search. The procedure was further developed for rapid serotyping of foot and
mouth disease virus (FMDV) relying on nanopore sequencing and offline BLAST
search. The offline BLAST search was highly successful in categorizing seven FMDV
serotypes by using the P1 region (specificity: 98.3%) instead of whole genome
(24.8%), P2 (23.6%) or P3 (21.4%) regions.
A peptide microarray was used to identify a bundle of Zika Virus (ZIKV) specific
antibody targets for the differentiation of other flaviviruses. Briefly, a total of 1643
overlapping oligopeptides were synthesized and printed onto glass slides. The
oligopeptides cover the whole polyproteins of ZIKV originated from Africa, Brazil, USA
Summary
VI
and French Polynesia. The ZIKV scanning microarray chips were applied to examine
three human serum pools from Zika outbreaks in Senegal and Cape Verde, in Brazil,
and from overseas travellers returning to the EU as well as a pool of well described
sera from patients that had suffered from dengue, yellow fever, tick-borne encephalitis
or West Nile virus infections. Altogether, sixty-eight antibody target regions were
identified, most of them previously unknown, from which thirteen could be classified as
potentially ZIKV specific.
While the fast and sensitive extraction of DNA in the field was shown to enable genomic
assays at PON, the two sequencing protocols have the potential to provide field
applicable metagenomic diagnostics at point of need as workflows were performed in
a mobile suitcase laboratory. The results obtained by the peptide microarray can be
seen as a founding set of analytical tools for serological discrimination of ZIKV from
other flaviviruses.
In conclusion, this PhD study paves the way for reliable POCT and PONT and
represents an example of research at One Health level, in which the health of human,
animal and environment matter

Georg-August-University Göttingen

High resolution differentiation of infectious agents at the level of antibody and nucleic acid by using peptide microarray and nanopore sequencing

https://ediss.uni-goettingen.de/bitstream/21.11130/00-1735-0000-0003-C18C-5/1/Thesis_SH_einreichen.pdf

High resolution differentiation of infectious agents at the level of antibody and nucleic acid by using peptide microarray and nanopore sequencing

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