Se estudiaron siete cepas de herpesvirus equino 1 (EHV-1) aisladas en Argentina desde 1979 hasta 1996 y una cepa de referencia japonesa, analizándose los patrones de restricción del ADN, perfiles proteicos en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y los biotipos, para determinar posibles diferencias entre las mismas y su correlación con la patogenicidad en el ratón. El análisis genómico con enzimas de restricción demostró que todas las cepas pertenecen al tipo 1P de EHV-1. Sólo el primer aislamiento realizado en el país (cepa SP) mostró diferencias en su patrón de restricción del ADN. Esta cepa y la cepa aislada en el año 1985 (cepa LP) presentaron además diferencias en sus perfiles proteicos. El estudio de patogenicidad en ratones indicó la presencia de tres biotipos, no encontrándose correlación con las variaciones halladas en los electroferotipos y con la sintomatología clínica en el equino.Seven strains of equine herpesvirus 1 (EHV-1) isolated in Argentina from 1979 to 1996 and reference Japanese strain, were compared by restriction fragments analysis (RFA), polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and inoculation of baby mice. The RFA revealed that all EHV-1 strains belonged to genome type 1P. Only the first isolate (SP strain) showed differences. This strain and the LP strain isolated in 1985 presented a small differences for SDS-PAGE analysis. Baby mice inoculation revealed that three biotypes could be distinguished on the basis of pathogenicity. However, no strict correlation with pathogenicity in the natural host was seen.Facultad de Ciencias Veterinaria

Cid de La Paz, Viviana

Echeverría, María Gabriela

Etcheverrigaray, María Elisa

Galosi, Cecilia Mónica

Oliva, Graciela A.

Vila Roza, M. V.

Analecta Veterinaria

SEDICI - Repositorio de la UNLP

35ISSN 0365-5148             ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40
Virus Herpes Equino Tipo 1Trabajos de Investigación
Dirección para correspondencia: C.M.Galosi C.C. 296, (1900) La Plata, ARGENTINA.
VIRUS HERPES EQUINO TIPO 1 (EHV-1):
PATRONES DE RESTRICCIÓN DE ADN, PERFILES PROTEICOS
Y ESTUDIO DE PATOGENICIDAD EN RATONES
C.M. Galosi1,2, M.G. Echeverría1,3, M.V. Vila Roza1,4, V. Cid de La Paz1,5 ,
G.A. Oliva1, M.E. Etcheverrigaray1
1Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Nacional de La Plata
2Investigador Adjunto c/D CIC, Provincia de Buenos Aires.
3Investigador Asistente CONICET. 4Becaria de Iniciación de CIC, Provincia de Buenos Aires
5Profesional de Apoyo de CIC, Provincia de Buenos Aires
RESUMEN: Se estudiaron siete cepas de herpesvirus equino 1 (EHV-1) aisladas en Ar-
gentina desde 1979 hasta 1996 y una cepa de referencia japonesa, analizándose los
patrones de restricción del ADN, perfiles proteicos en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
y los biotipos, para determinar posibles diferencias entre las mismas y su correlación
con la patogenicidad en el ratón. El análisis genómico con enzimas de restricción demos-
tró que todas las cepas pertenecen al tipo 1P de EHV-1. Sólo el primer aislamiento reali-
zado en el país (cepa SP) mostró diferencias en su patrón de restricción del ADN. Esta
cepa y la cepa aislada en el año 1985 (cepa LP) presentaron además diferencias en sus
perfiles proteicos. El estudio de patogenicidad en ratones indicó la presencia de tres
biotipos, no encontrándose correlación con las variaciones halladas en los electroferoti-
pos y con la sintomatología clínica en el equino.
PALABRAS CLAVES: Virus herpes equino 1, Patrones de restricción del ADN, Electro-
foresis en geles de poliacrilamida, Patogenicidad en ratones.
EQUINE HERPESVIRUS TYPE 1 (EHV-1): RESTRICTION
FRAGMENT PATTERNS, POLYACRYLAMIDE GEL
ELECTROPHORESIS PROFILES AND PATHOGENICITY
IN BABY MICE
ABSTRACT: Seven strains of equine herpesvirus 1 (EHV-1) isolated in Argentina from
1979 to 1996 and reference Japanese strain, were compared by restriction fragments
analysis (RFA), polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and inoculation of baby
mice. The RFA revealed that all EHV-1 strains belonged to genome type 1P. Only the first
isolate (SP strain) showed differences. This strain and the LP strain isolated in 1985
presented a small differences for SDS-PAGE analysis. Baby mice inoculation revealed
that three biotypes could be distinguished on the basis of pathogenicity. However, no
strict correlation with pathogenicity in the natural host was seen.
KEY WORDS: Equine herpesvirus 1, Restriction enzyme patterns, Polyacryalamide gel
electrophoresis, Pathogenicity in baby mice
36 ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40                                        ISSN 0325-5148
C.M.Galosi y col.
INTRODUCCIÓN
El virus herpes equino tipo 1 (EHV-1) fue
aislado por primera vez de material de fetos
abortados en EE.UU. en 1933 (Dimock et al.,
1947). Se encuentra distribuido por todo el
mundo y produce cuatro manifestaciones clíni-
cas importantes en el equino: enfermedad res-
piratoria, aborto, síndrome neonatal y enferme-
dad nerviosa (Allen y Bryans, 1986; Crabb y
Studdert, 1995).
En nuestro país se detectaron anticuer-
pos (Ac) por primera vez en el año 1965
(Matumoto et al., 1965) y en 1978 se determinó
la existencia de 25% de reactores en la Provin-
cia de Buenos Aires (Etcheverrigaray et al.,
1978). En 1979 se realizó el primer aislamiento
a partir de un feto abortado (Etcheverrigaray et
al., 1982), en 1984 se describieron brotes epi-
zoóticos de enfermedad nerviosa asociada a este
virus (Nosetto et al., 1985) y en 1985 se realizó
el aislamiento a partir de leucocitos de un equi-
no con cuadro clínico respiratorio (Galosi et al.,
1989). Desde ese momento han sido aisladas
numerosas cepas, tanto de animales vacuna-
dos como de no vacunados.
El control de esta virosis se realiza por
medio de vacunas atenuadas e inactivadas
(Kirisawa et al., 1994). En Argentina, desde el
año 1982, sólo está permitido el uso de vacu-
nas inactivadas no existiendo ningún tipo de
información sobre el uso de otro tipo de vacu-
nas antes de esa fecha.
Distintos grupos de investigación han rea-
lizado varios estudios in vivo e in vitro para de-
mostrar diferencias entre las cepas aisladas de
fetos abortados y enfermedad neonatal de aque-
llas provenientes de casos respiratorios (Engels
et al., 1986; Kirisawa et al., 1994). Las endo-
nucleasas de restricción, útiles para detección
de heterogeneidad entre los aislamientos vira-
les han confirmado que el EHV-1 posee un ge-
notipo simple y dos electroferotipos [1P y 1B]
(Allen et al., 1983) aunque algunos autores
hallaron cepas compuestas de variantes atenua-
das y virus salvaje (Palfi y Christensen, 1995).
El análisis por electroforesis en geles de polia-
crilamida de las proteínas estructurales y no
estructurales del virus aportan datos sobre di-
ferencias de movilidad intratípicas (Allen et al.,
1983). Los estudios en ratones lactantes demos-
traron que existen cuatro biotipos de acuerdo
al órganotropismo y patogenicidad, que no hay
correlación con la patogenicidad en el equino y
que los diferentes signos clínicos se deben a las
condiciones del mismo (Allen et al., 1983;
Nowotny et al., 1987; Palfi y Christensen, 1995;
Patel y Edington, 1983).
El propósito del presente trabajo fue de-
terminar el perfil proteico, el genotipo y el bioti-
po de 7 cepas de EHV-1 aisladas en Argentina
entre 1979 y 1996 para determinar el grado de
homogeneidad entre las mismas y establecer su
correlación con la patogenicidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Virus y aislamientos virales: Se estudia-
ron siete cepas de EHV-1 aisladas en Argenti-
na (Tabla Nº 1). Las cepas SP y LP fueron aisla-
das en cultivos primarios de riñón de feto equi-
no (EFK) y las restantes fueron aisladas en cé-
lulas de línea RK13 (riñón de conejo). La cepa SP
fue replicada 62 veces en células heterólogas;
LP y PMo fueron replicadas 18 veces en células
RK13 y las restantes cepas fueron estudiadas a
partir de su aislamiento. La cepa japonesa HH1,
de electroferotipo 1P, fue incluida como cepa
de referencia (Kawakami, Y, 1993).
Cultivos celulares: se utilizaron células
RK13 desarrolladas con Medio Mínimo Esencial
(MEM) (Lab. Nissui, Japón) suplementado con
10% de Suero Fetal Bovino (SFB), antibióticos
y antimicóticos. Para el mantenimiento de las
células se usó el mismo medio de cultivo con
2% de SFB.
Extracción del ADN viral: monocapas de
células RK13 fueron infectadas con cada una de
las cepas utilizando multiplicidad de infección
(mdi) = 0,5. Cuando el efecto citopático (ECP)
fue extensivo, las monocapas se levantaron, se
lavaron con solución tamponada de fosfatos
(PBS), se lisaron con TEN (100 mM de Tris-HCl
pH 8.5, 12.5 mM de EDTA pH 8.0, 150 mM de
ClNa y 1% de SDS) y luego se trataron durante
4 horas a 50° C con 0,2 mg/ml de Proteinasa
K. El ADN fue extraído con una mezcla de fe-
nol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) y
luego precipitado con etanol puro (Echeverría
et al., 1994).
Análisis con endonucleasas de restricción
(RE): aproximadamente 1,5 µg de ADN de cada
una de las cepas fueron digeridos a 37° C du-
rante toda la noche con las enzimas BamHI y
BgIII. Luego se separaron por electroforesis en
geles de agarosa al 0,7% (140 x 150 x 5 mm) en
solución de Tris-acetato (40 mM Tris-acetato, 1
mM EDTA, pH 8.0) a 20 V durante 16 horas, se
tiñeron con bromuro de etidio (1 µg/ml) y se
visualizaron con luz UV.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
(SDS-PAGE): Monocapas de células RK13 fueron
infectadas con cada una de las cepas virales
con mdi= 0,5 y mantenidas con MEM libre de
SFB. Cuando el ECP fue generalizado, las célu-
las y los sobrenadantes se levantaron, se cen-
37ISSN 0365-5148             ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40
Virus Herpes Equino Tipo 1
trifugaron y los paquetes celulares obtenidos
se lavaron con PBS y se solubilizaron con
Nonidet P-40 al 1% en TEN. Se procedió de la
misma manera con células sin infectar como
control (AgC). Estas muestras (Ags) fueron pro-
cesadas para trabajar en condiciones reduci-
das y se separaron por electroforesis en geles
de poliacrilamida al 7,5% (170 x 190 x 1 mm)
empleando un sistema de buffer discontinuo
(Laemmli 1970) durante 7 horas a 30 mA. Los
geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie
y se decoloraron en solución de metanol ácido.
Patogenicidad en ratones: Se utilizaron 7
ratones (cepa CF-1) de 3 días de edad por cada
una de las cepas virales en estudio y 7 ratones
como controles. Se inocularon vía intracerebral
(IC) utilizando 0,01 ml de cada suspensión vi-
ral clarificadas por centrifugación (DICT 50%=
104.5 _ 105.0) y sobrenadante de células no infec-
tadas para el caso de los controles. Los ratones
muertos en las primeras 48 horas post-inocu-
lación (pi) no fueron considerados y aquellos
que murieron y/o mostraron síntomas nervio-
sos a partir del tercer día pi fueron sacrificados
y sus órganos (cerebro, pulmón, hígado, riño-
nes y bazo) conservados a -70° C. Los ratones
sobrevivientes fueron sacrificados a los 21 días
pi. Todas las muestras se procesaron para el
reaislamiento de las cepas y se inocularon so-
bre monocapas preformadas de células RK13.
Se realizaron tres pasajes ciegos antes de dar
por negativa a la muestra.
Foto 1: Patrones de restricción del ADN obtenidos con Bam HI, de 10 cepas de EHV-1 aisladas en
la Argentina entre 1979 y 1996.
Foto Nº2: Patrones de restricción del ADN obtenidos con BgIII, de 10 cepas de EHV-1 aisladas en
la Argentina entre 1979 y 1996.
M: marcador de peso molecular (l DNA digerido con HindIII) expresado en kilobases. La
nomenclatura de los fragmentos se cita a la derecha de la cepa de referencia HH1. Los
asteriscos indican las variaciones halladas.
M: marcador de peso molecular (l DNA digerido con Hind III) expresado en
kilobases. La nomenclatura de los fragmentos se cita a la derecha de la cepa
de referencia HH1
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C.M.Galosi y col.
RESULTADOS
La foto 1 muestra los patrones de restric-
ción obtenidos con BamHI. La cepa SP puede
ser diferenciada de las otras por la variación en
la movilidad del grupo de fragmentos “h, i, j y
k”. Además esta cepa carece del fragmento “e”
que está presente en el resto de los aislamien-
tos aunque con diferente movilidad que la cepa
de referencia HH1. El grupo “q, r, s” es similar
en todas las cepas excepto en O1 en la que este
grupo demuestra poseer menor movilidad.
En los electroferotipos con BglII (Foto Nº2)
puede observarse que la cepa SP se diferencia
de las restantes por la movilidad del grupo de
fragmentos “b, c, y d”. Las cepas K y O1 de-
muestran una leve diferencia de movilidad del
grupo “k, l y m” al igual que en la cepa HH1
aunque en este último caso, este grupo de frag-
mentos demuestra ser mas liviano.
Mediante el uso de la técnica de SDS-
PAGE, los Ag de membranas celulares modifi-
cadas por la acción de cada uno de los virus en
estudio y el AgC otorgaron un número elevado
de bandas proteicas. La única diferencia halla-
da fue la pérdida de la banda correspondiente
al peso molecular de 200 kD en las cepas SP y
LP.
Por su patogenicidad en ratones lactan-
tes las cepas fueron categorizadas de acuerdo
a los siguientes criterios: letalidad (*), y capaci-
dad de reaislamiento a partir de cerebro (**) y
vísceras (***) (Nowotny et al., 1987; Palfi y
Christensen, 1995; Patel y Edington, 1983) tal
como se demuestra en la Tabla Nº2.
En el grupo A se encuentran las cepas
que mataron a la totalidad de los ratones y que
pudieron ser reaisladas de cerebro y vísceras.
En el grupo B se incluyen a las cepas que no
mataron a la totalidad de los ratones (SP) y en
el grupo C se presentan las cepas que no fue-
ron letales (LP). En estos dos últimos grupos el
virus sólo fue reaislado de cerebro.
DISCUSIÓN
El RE análisis con BamHI demostró que
todas las cepas pertenecen al tipo 1P y no se
observan variantes 1B (Allen y Bryans, 1986).
Los patrones de restricción no presentaron ca-
racterísticas de recombinaciones entre genomas
1P y vacunas atenuadas como hallaron otros
autores (Meyer et al., 1987; Palfi y Christensen,
1995). No se demostró variabilidad en el frag-
mento “g” reafirmando que éste es altamente
estable. Únicamente en la cepa SP se observó
pérdida del fragmento BamHI “e”, lo que podría
deberse al efecto de la mayor cantidad de pasa-
jes de esta cepa en células heterólogas (Allen et
al., 1983; Studdert et al., 1986). Las cepas res-
tantes presentaron pequeñas diferencias de
movilidad de algunos de los fragmentos de res-
tricción.
En el estudio de movilidad de las proteí-
nas, las variaciones halladas en la banda co-
rrespondiente a la glicoproteína (gp) de 200  kD
Tabla Nª 1: Cepas de herpesvirus equino 1 (EHV-1) empleadas en este estudio.
* Cepa japonesa de referencia
Tabla Nº 2: Clasificación de acuerdo a su patogenicidad en ratón (cepa CF-1) de 3 días de edad,
de cepas de EHV-1 aisladas en Argentina entre 1979 y 1996.
* Cepa japonesa de referencia
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Virus Herpes Equino Tipo 1
de PM en las cepas SP y LP confirman los datos
aportados por otros grupos de trabajo que in-
dican que esta gp es variable dentro del mismo
tipo viral (Turtinen y Allen, 1982).
En concordancia con Patel y Edington
(1983), las cepas de reducida letalidad y no le-
tales (grupos B y C) sólo pudieron ser reaisla-
das de cerebro y a diferencia de otros autores
no se encontraron cepas “no letales y no reais-
ladas” clasificadas en el grupo denominado D
(Palfi y Christensen, 1995). Por otro lado, las
cepas LP y O1, provenientes de casos clínicos
diferentes en equinos presentaron las mismas
características patogénicas para el ratón, reafir-
mando que no existe correlación entre las ma-
nifestaciones clínicas en equinos y la patogeni-
cidad en ratón lactante.
Como conclusión del presente trabajo
podemos inferir que no existen mayores dife-
rencias entre los perfiles proteicos de las cepas
en estudio como así tampoco se observó corre-
lación entre las variaciones halladas en los elec-
troferotipos y la patogenicidad en el ratón.
Esta es la primera investigación epidemio-
lógica de cepas argentinas de EHV-1. Debemos
identificar y determinar en el futuro, la impli-
cancia de la heterogeneidad hallada en los pa-
trones de restricción del primer aislamiento rea-
lizado en el país.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece a la Cátedra de Animales de
Laboratorio de la Facultad de Ciencias Veteri-
narias de la UNLP por haber provisto gra-
tuitamente los animales de experimentación
utilizados en este estudio. Este trabajo ha sido
financiado por la Universidad Nacional de La
Plata y la Agencia Internacional de Coopera-
ción del Japón (JICA).
40 ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40                                        ISSN 0325-5148
C.M.Galosi y col.
BIBLIOGRAFÍA
1. Allen, G.P.;  Yeargan, M.R. ; Bryans, J.T. Alter-
ations in the equine herpesvirus 1 genome after in
vitro and in vivo virus passage. Infection and Im-
munity 1983; 40: 436-9
2. Allen, G.P..; Yeargan M.S.; Turtinen, M.S..; Bryans,
J.T.; Mc Collum W.H. Molecular epizootiologic stud-
ies of equine herpesvirus-1 by restriction endonu-
clease fingerprinting of viral DNA. American Jour-
nal Veterinary Research 1983; 44: 263-71
3. Allen, G.P.; Bryans, J.T. Molecular epizootiology,
pathogenesis and prophylaxis of Equine Herpesvi-
rus-1 infections. Progress in Veterinary Microbiol-
ogy and Immunology 1986; 2: 78-144.
4. Crabb, B.S.; Studdert, M. Equine herpesviruses 4
(Equine rhinopneumonitis virus) and 1 (Equine abor-
tion virus). Advances in Virus Research 1995; 45:
153-90
5. Dimock, W.W.; Edwards, P.E.; Bruner, D.W. In-
fections observed in equine fetuses and foals. Cornell
Vet 1947; 37: 88-9
6. Echeverria, M.G.; Norimine, J.; Galosi, C.M.; Oliva,
G.A. ; Etcheverrigaray, M.E.; Nosetto, E.O.; Tohya,
Y.; Mikami, T. The genotype of Aujeszky’s disease
viruses isolated in Argentina. Journal of Veterinary
Medical Sciences 1994; 56: 985-7
7. Engels, M.; Nowotny, N.; Metzler A.E.; Wyler R.;
Burki, F. Genomic and antigenic comparison of an
equine herpesvirus-1 (EHV-1) isolate from the 1983
lipizan abortion storm with EHV-1 reference strains.
Microbiologica 1986; 9:221-34
8. Etcheverrigaray, M.E.; Sciutto, D.; Schudel, A.A.;
Perez Azumendi, R. Rinoneumonitis equina I: de-
tección de anticuerpos precipitantes en caballos de
la provincia de Buenos Aires. Revista Militar Veteri-
naria 1978; 25: 173-5
9. Etcheverrigaray, M.E.; Oliva, G.A.; Gonzalez, E.T.;
Nosetto, E.O.; Martin, A.A. Comportamiento de una
cepa de HVE-1 aislada de un feto abortado. Revista
Militar Veterinaria 1982; 30: 138-9
10. Galosi, C.M.; Nosetto, E.O.; Gimeno, E,J.; Gomez
Dunn, C.; Etcheverrigaray, M.E.; Ando, Y. Equine
herpesvirus-1 (EHV-1): characterization of a viral
strain isolated from equine plasma in Argentine. Rev
Sci Tech Off Int Epiz 1989; 8,1:117-22
11. Kawakami, Y. The genomic diversity among
equine herpesvirus-1 strains isolated in Japan. Ar-
chives of Virology 1993; 129: 11-22
12. Kirisawa, R.; UI, S.; Takahashi, A.; Kawakami,
Y.; Iwai, H. Comparison of the genomes of attenu-
ated equine herpesvirus-1 strains with their parent
virulent strain. Virology 1994; 200: 651-60
13. Laemmli, V. Cleavage and structural proteins
during the assembly of the head of bacteriophage
T4. Nature 1970; 227: 680-5
14. Matumoto, M.; Ishizaki, R.; Shimizu, T. Sero-
logical survey of equine rhinopneumonitis virus in-
fections among horses in various countries. Arch
Ges Virusforsch 1965; 50: 606-23
15. Meyer, H.; Hubert, P.H.; Eichhorn, W. Changes
in restriction enzyme pattern of the Equine herpes
virus type 1 (EHV-1) strain Rac H DNA during at-
tenuation. J Vet Med B 1987; 34: 310-13
16. Nosetto, E.O.; Monina, M.I.; Baschar, H.; Galosi,
C.M.; Gallo, G.; Idiart, J.R.; Gimeno, E,J. Síndrome
neurológico asociado a herpes virus equino tipo 1
(HVE-1). Med Vet 1985; 2: 583-8
17. Nowotny, N.; Burtscher, H.; Burki, F.
Neuropathogenicity for suckling mice of Equine her-
pesvirus 1 from the Lipizzan outbreak 1983 and of
selected other EHV 1 strains. J Vet Med B 1987; 34:
441-8
18. Palfi, V.; Christensen, L.S. Analysis of restric-
tion fragment patterns (RFPs) and pathogenicity in
baby mice of equine herpesvirus 1 and 4 (EHV-1 and
EHV-4) strains circulating in Danish horses. Veteri-
nary Microbiology 1995; 47: 199-204
19. Patel, J.R.; Edington, N. The pathogenicity in
mice of respiratory, abortion and paresis isolates of
equine herpesvirus-1. Veterinary Microbiology 1983;
8: 301-5
20. Studdert, M.J.; Fitzpatrick, D.R.; Browning, G.F.;
Cullinane, A.A.; Whalley, J.M. Equine herpesvirus
genomes: heterogeneity of naturally occurring type
4 isolates and of a type 1 isolate after heterologous
cell passage. Arch Virol 1986; 91: 375-81
21. Turtinen, L.W.; Allen, G.P. Identification of the
envelope surface glycoproteins of equine herpesvi-
rus type 1. J Gen Virol 1982; 63: 481-5


Spanish

Equine herpesvirus type 1 (EHV-1): restriction fragment patterns, polyacrylamide gel electrophoresis profiles and pathogenicity in baby mice

Servicio de Difusión de la Creación Intelectual

35ISSN 0365-5148             ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40Virus Herpes Equino Tipo 1Trabajos de InvestigaciónDirección para correspondencia: C.M.Galosi C.C. 296, (1900) La Plata, ARGENTINA.VIRUS HERPES EQUINO TIPO 1 (EHV-1):PATRONES DE RESTRICCIÓN DE ADN, PERFILES PROTEICOSY ESTUDIO DE PATOGENICIDAD EN RATONESC.M. Galosi1,2, M.G. Echeverría1,3, M.V. Vila Roza1,4, V. Cid de La Paz1,5 ,G.A. Oliva1, M.E. Etcheverrigaray11Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias,Universidad Nacional de La Plata2Investigador Adjunto c/D CIC, Provincia de Buenos Aires.3Investigador Asistente CONICET. 4Becaria de Iniciación de CIC, Provincia de Buenos Aires5Profesional de Apoyo de CIC, Provincia de Buenos AiresRESUMEN: Se estudiaron siete cepas de herpesvirus equino 1 (EHV-1) aisladas en Ar-gentina desde 1979 hasta 1996 y una cepa de referencia japonesa, analizándose lospatrones de restricción del ADN, perfiles proteicos en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)y los biotipos, para determinar posibles diferencias entre las mismas y su correlacióncon la patogenicidad en el ratón. El análisis genómico con enzimas de restricción demos-tró que todas las cepas pertenecen al tipo 1P de EHV-1. Sólo el primer aislamiento reali-zado en el país (cepa SP) mostró diferencias en su patrón de restricción del ADN. Estacepa y la cepa aislada en el año 1985 (cepa LP) presentaron además diferencias en susperfiles proteicos. El estudio de patogenicidad en ratones indicó la presencia de tresbiotipos, no encontrándose correlación con las variaciones halladas en los electroferoti-pos y con la sintomatología clínica en el equino.PALABRAS CLAVES: Virus herpes equino 1, Patrones de restricción del ADN, Electro-foresis en geles de poliacrilamida, Patogenicidad en ratones.EQUINE HERPESVIRUS TYPE 1 (EHV-1): RESTRICTIONFRAGMENT PATTERNS, POLYACRYLAMIDE GELELECTROPHORESIS PROFILES AND PATHOGENICITYIN BABY MICEABSTRACT: Seven strains of equine herpesvirus 1 (EHV-1) isolated in Argentina from1979 to 1996 and reference Japanese strain, were compared by restriction fragmentsanalysis (RFA), polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and inoculation of babymice. The RFA revealed that all EHV-1 strains belonged to genome type 1P. Only the firstisolate (SP strain) showed differences. This strain and the LP strain isolated in 1985presented a small differences for SDS-PAGE analysis. Baby mice inoculation revealedthat three biotypes could be distinguished on the basis of pathogenicity. However, nostrict correlation with pathogenicity in the natural host was seen.KEY WORDS: Equine herpesvirus 1, Restriction enzyme patterns, Polyacryalamide gelelectrophoresis, Pathogenicity in baby mice36 ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40                                        ISSN 0325-5148C.M.Galosi y col.INTRODUCCIÓNEl virus herpes equino tipo 1 (EHV-1) fueaislado por primera vez de material de fetosabortados en EE.UU. en 1933 (Dimock et al.,1947). Se encuentra distribuido por todo elmundo y produce cuatro manifestaciones clíni-cas importantes en el equino: enfermedad res-piratoria, aborto, síndrome neonatal y enferme-dad nerviosa (Allen y Bryans, 1986; Crabb yStuddert, 1995).En nuestro país se detectaron anticuer-pos (Ac) por primera vez en el año 1965(Matumoto et al., 1965) y en 1978 se determinóla existencia de 25% de reactores en la Provin-cia de Buenos Aires (Etcheverrigaray et al.,1978). En 1979 se realizó el primer aislamientoa partir de un feto abortado (Etcheverrigaray etal., 1982), en 1984 se describieron brotes epi-zoóticos de enfermedad nerviosa asociada a estevirus (Nosetto et al., 1985) y en 1985 se realizóel aislamiento a partir de leucocitos de un equi-no con cuadro clínico respiratorio (Galosi et al.,1989). Desde ese momento han sido aisladasnumerosas cepas, tanto de animales vacuna-dos como de no vacunados.El control de esta virosis se realiza pormedio de vacunas atenuadas e inactivadas(Kirisawa et al., 1994). En Argentina, desde elaño 1982, sólo está permitido el uso de vacu-nas inactivadas no existiendo ningún tipo deinformación sobre el uso de otro tipo de vacu-nas antes de esa fecha.Distintos grupos de investigación han rea-lizado varios estudios in vivo e in vitro para de-mostrar diferencias entre las cepas aisladas defetos abortados y enfermedad neonatal de aque-llas provenientes de casos respiratorios (Engelset al., 1986; Kirisawa et al., 1994). Las endo-nucleasas de restricción, útiles para detecciónde heterogeneidad entre los aislamientos vira-les han confirmado que el EHV-1 posee un ge-notipo simple y dos electroferotipos [1P y 1B](Allen et al., 1983) aunque algunos autoreshallaron cepas compuestas de variantes atenua-das y virus salvaje (Palfi y Christensen, 1995).El análisis por electroforesis en geles de polia-crilamida de las proteínas estructurales y noestructurales del virus aportan datos sobre di-ferencias de movilidad intratípicas (Allen et al.,1983). Los estudios en ratones lactantes demos-traron que existen cuatro biotipos de acuerdoal órganotropismo y patogenicidad, que no haycorrelación con la patogenicidad en el equino yque los diferentes signos clínicos se deben a lascondiciones del mismo (Allen et al., 1983;Nowotny et al., 1987; Palfi y Christensen, 1995;Patel y Edington, 1983).El propósito del presente trabajo fue de-terminar el perfil proteico, el genotipo y el bioti-po de 7 cepas de EHV-1 aisladas en Argentinaentre 1979 y 1996 para determinar el grado dehomogeneidad entre las mismas y establecer sucorrelación con la patogenicidad.MATERIALES Y MÉTODOSVirus y aislamientos virales: Se estudia-ron siete cepas de EHV-1 aisladas en Argenti-na (Tabla Nº 1). Las cepas SP y LP fueron aisla-das en cultivos primarios de riñón de feto equi-no (EFK) y las restantes fueron aisladas en cé-lulas de línea RK13 (riñón de conejo). La cepa SPfue replicada 62 veces en células heterólogas;LP y PMo fueron replicadas 18 veces en célulasRK13 y las restantes cepas fueron estudiadas apartir de su aislamiento. La cepa japonesa HH1,de electroferotipo 1P, fue incluida como cepade referencia (Kawakami, Y, 1993).Cultivos celulares: se utilizaron célulasRK13 desarrolladas con Medio Mínimo Esencial(MEM) (Lab. Nissui, Japón) suplementado con10% de Suero Fetal Bovino (SFB), antibióticosy antimicóticos. Para el mantenimiento de lascélulas se usó el mismo medio de cultivo con2% de SFB.Extracción del ADN viral: monocapas decélulas RK13 fueron infectadas con cada una delas cepas utilizando multiplicidad de infección(mdi) = 0,5. Cuando el efecto citopático (ECP)fue extensivo, las monocapas se levantaron, selavaron con solución tamponada de fosfatos(PBS), se lisaron con TEN (100 mM de Tris-HClpH 8.5, 12.5 mM de EDTA pH 8.0, 150 mM deClNa y 1% de SDS) y luego se trataron durante4 horas a 50° C con 0,2 mg/ml de ProteinasaK. El ADN fue extraído con una mezcla de fe-nol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1) yluego precipitado con etanol puro (Echeverríaet al., 1994).Análisis con endonucleasas de restricción(RE): aproximadamente 1,5 µg de ADN de cadauna de las cepas fueron digeridos a 37° C du-rante toda la noche con las enzimas BamHI yBgIII. Luego se separaron por electroforesis engeles de agarosa al 0,7% (140 x 150 x 5 mm) ensolución de Tris-acetato (40 mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0) a 20 V durante 16 horas, setiñeron con bromuro de etidio (1 µg/ml) y sevisualizaron con luz UV.Electroforesis en geles de poliacrilamida(SDS-PAGE): Monocapas de células RK13 fueroninfectadas con cada una de las cepas viralescon mdi= 0,5 y mantenidas con MEM libre deSFB. Cuando el ECP fue generalizado, las célu-las y los sobrenadantes se levantaron, se cen-37ISSN 0365-5148             ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40Virus Herpes Equino Tipo 1trifugaron y los paquetes celulares obtenidosse lavaron con PBS y se solubilizaron conNonidet P-40 al 1% en TEN. Se procedió de lamisma manera con células sin infectar comocontrol (AgC). Estas muestras (Ags) fueron pro-cesadas para trabajar en condiciones reduci-das y se separaron por electroforesis en gelesde poliacrilamida al 7,5% (170 x 190 x 1 mm)empleando un sistema de buffer discontinuo(Laemmli 1970) durante 7 horas a 30 mA. Losgeles se tiñeron con azul brillante de Coomassiey se decoloraron en solución de metanol ácido.Patogenicidad en ratones: Se utilizaron 7ratones (cepa CF-1) de 3 días de edad por cadauna de las cepas virales en estudio y 7 ratonescomo controles. Se inocularon vía intracerebral(IC) utilizando 0,01 ml de cada suspensión vi-ral clarificadas por centrifugación (DICT 50%=104.5 _ 105.0) y sobrenadante de células no infec-tadas para el caso de los controles. Los ratonesmuertos en las primeras 48 horas post-inocu-lación (pi) no fueron considerados y aquellosque murieron y/o mostraron síntomas nervio-sos a partir del tercer día pi fueron sacrificadosy sus órganos (cerebro, pulmón, hígado, riño-nes y bazo) conservados a -70° C. Los ratonessobrevivientes fueron sacrificados a los 21 díaspi. Todas las muestras se procesaron para elreaislamiento de las cepas y se inocularon so-bre monocapas preformadas de células RK13.Se realizaron tres pasajes ciegos antes de darpor negativa a la muestra.Foto 1: Patrones de restricción del ADN obtenidos con Bam HI, de 10 cepas de EHV-1 aisladas enla Argentina entre 1979 y 1996.Foto Nº2: Patrones de restricción del ADN obtenidos con BgIII, de 10 cepas de EHV-1 aisladas enla Argentina entre 1979 y 1996.M: marcador de peso molecular (l DNA digerido con HindIII) expresado en kilobases. Lanomenclatura de los fragmentos se cita a la derecha de la cepa de referencia HH1. Losasteriscos indican las variaciones halladas.M: marcador de peso molecular (l DNA digerido con Hind III) expresado enkilobases. La nomenclatura de los fragmentos se cita a la derecha de la cepade referencia HH138 ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40                                        ISSN 0325-5148C.M.Galosi y col.RESULTADOSLa foto 1 muestra los patrones de restric-ción obtenidos con BamHI. La cepa SP puedeser diferenciada de las otras por la variación enla movilidad del grupo de fragmentos “h, i, j yk”. Además esta cepa carece del fragmento “e”que está presente en el resto de los aislamien-tos aunque con diferente movilidad que la cepade referencia HH1. El grupo “q, r, s” es similaren todas las cepas excepto en O1 en la que estegrupo demuestra poseer menor movilidad.En los electroferotipos con BglII (Foto Nº2)puede observarse que la cepa SP se diferenciade las restantes por la movilidad del grupo defragmentos “b, c, y d”. Las cepas K y O1 de-muestran una leve diferencia de movilidad delgrupo “k, l y m” al igual que en la cepa HH1aunque en este último caso, este grupo de frag-mentos demuestra ser mas liviano.Mediante el uso de la técnica de SDS-PAGE, los Ag de membranas celulares modifi-cadas por la acción de cada uno de los virus enestudio y el AgC otorgaron un número elevadode bandas proteicas. La única diferencia halla-da fue la pérdida de la banda correspondienteal peso molecular de 200 kD en las cepas SP yLP.Por su patogenicidad en ratones lactan-tes las cepas fueron categorizadas de acuerdoa los siguientes criterios: letalidad (*), y capaci-dad de reaislamiento a partir de cerebro (**) yvísceras (***) (Nowotny et al., 1987; Palfi yChristensen, 1995; Patel y Edington, 1983) talcomo se demuestra en la Tabla Nº2.En el grupo A se encuentran las cepasque mataron a la totalidad de los ratones y quepudieron ser reaisladas de cerebro y vísceras.En el grupo B se incluyen a las cepas que nomataron a la totalidad de los ratones (SP) y enel grupo C se presentan las cepas que no fue-ron letales (LP). En estos dos últimos grupos elvirus sólo fue reaislado de cerebro.DISCUSIÓNEl RE análisis con BamHI demostró quetodas las cepas pertenecen al tipo 1P y no seobservan variantes 1B (Allen y Bryans, 1986).Los patrones de restricción no presentaron ca-racterísticas de recombinaciones entre genomas1P y vacunas atenuadas como hallaron otrosautores (Meyer et al., 1987; Palfi y Christensen,1995). No se demostró variabilidad en el frag-mento “g” reafirmando que éste es altamenteestable. Únicamente en la cepa SP se observópérdida del fragmento BamHI “e”, lo que podríadeberse al efecto de la mayor cantidad de pasa-jes de esta cepa en células heterólogas (Allen etal., 1983; Studdert et al., 1986). Las cepas res-tantes presentaron pequeñas diferencias demovilidad de algunos de los fragmentos de res-tricción.En el estudio de movilidad de las proteí-nas, las variaciones halladas en la banda co-rrespondiente a la glicoproteína (gp) de 200  kDTabla Nª 1: Cepas de herpesvirus equino 1 (EHV-1) empleadas en este estudio.* Cepa japonesa de referenciaTabla Nº 2: Clasificación de acuerdo a su patogenicidad en ratón (cepa CF-1) de 3 días de edad,de cepas de EHV-1 aisladas en Argentina entre 1979 y 1996.* Cepa japonesa de referencia39ISSN 0365-5148             ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40Virus Herpes Equino Tipo 1de PM en las cepas SP y LP confirman los datosaportados por otros grupos de trabajo que in-dican que esta gp es variable dentro del mismotipo viral (Turtinen y Allen, 1982).En concordancia con Patel y Edington(1983), las cepas de reducida letalidad y no le-tales (grupos B y C) sólo pudieron ser reaisla-das de cerebro y a diferencia de otros autoresno se encontraron cepas “no letales y no reais-ladas” clasificadas en el grupo denominado D(Palfi y Christensen, 1995). Por otro lado, lascepas LP y O1, provenientes de casos clínicosdiferentes en equinos presentaron las mismascaracterísticas patogénicas para el ratón, reafir-mando que no existe correlación entre las ma-nifestaciones clínicas en equinos y la patogeni-cidad en ratón lactante.Como conclusión del presente trabajopodemos inferir que no existen mayores dife-rencias entre los perfiles proteicos de las cepasen estudio como así tampoco se observó corre-lación entre las variaciones halladas en los elec-troferotipos y la patogenicidad en el ratón.Esta es la primera investigación epidemio-lógica de cepas argentinas de EHV-1. Debemosidentificar y determinar en el futuro, la impli-cancia de la heterogeneidad hallada en los pa-trones de restricción del primer aislamiento rea-lizado en el país.AGRADECIMIENTOSSe agradece a la Cátedra de Animales deLaboratorio de la Facultad de Ciencias Veteri-narias de la UNLP por haber provisto gra-tuitamente los animales de experimentaciónutilizados en este estudio. Este trabajo ha sidofinanciado por la Universidad Nacional de LaPlata y la Agencia Internacional de Coopera-ción del Japón (JICA).40 ANALECTA VETERINARIA 1998; 18,1/2: 35-40                                        ISSN 0325-5148C.M.Galosi y col.BIBLIOGRAFÍA1. Allen, G.P.;  Yeargan, M.R. ; Bryans, J.T. Alter-ations in the equine herpesvirus 1 genome after invitro and in vivo virus passage. Infection and Im-munity 1983; 40: 436-92. Allen, G.P..; Yeargan M.S.; Turtinen, M.S..; Bryans,J.T.; Mc Collum W.H. Molecular epizootiologic stud-ies of equine herpesvirus-1 by restriction endonu-clease fingerprinting of viral DNA. American Jour-nal Veterinary Research 1983; 44: 263-713. Allen, G.P.; Bryans, J.T. Molecular epizootiology,pathogenesis and prophylaxis of Equine Herpesvi-rus-1 infections. Progress in Veterinary Microbiol-ogy and Immunology 1986; 2: 78-144.4. Crabb, B.S.; Studdert, M. Equine herpesviruses 4(Equine rhinopneumonitis virus) and 1 (Equine abor-tion virus). Advances in Virus Research 1995; 45:153-905. Dimock, W.W.; Edwards, P.E.; Bruner, D.W. In-fections observed in equine fetuses and foals. CornellVet 1947; 37: 88-96. Echeverria, M.G.; Norimine, J.; Galosi, C.M.; Oliva,G.A. ; Etcheverrigaray, M.E.; Nosetto, E.O.; Tohya,Y.; Mikami, T. The genotype of Aujeszky’s diseaseviruses isolated in Argentina. Journal of VeterinaryMedical Sciences 1994; 56: 985-77. Engels, M.; Nowotny, N.; Metzler A.E.; Wyler R.;Burki, F. Genomic and antigenic comparison of anequine herpesvirus-1 (EHV-1) isolate from the 1983lipizan abortion storm with EHV-1 reference strains.Microbiologica 1986; 9:221-348. Etcheverrigaray, M.E.; Sciutto, D.; Schudel, A.A.;Perez Azumendi, R. Rinoneumonitis equina I: de-tección de anticuerpos precipitantes en caballos dela provincia de Buenos Aires. Revista Militar Veteri-naria 1978; 25: 173-59. Etcheverrigaray, M.E.; Oliva, G.A.; Gonzalez, E.T.;Nosetto, E.O.; Martin, A.A. Comportamiento de unacepa de HVE-1 aislada de un feto abortado. RevistaMilitar Veterinaria 1982; 30: 138-910. Galosi, C.M.; Nosetto, E.O.; Gimeno, E,J.; GomezDunn, C.; Etcheverrigaray, M.E.; Ando, Y. Equineherpesvirus-1 (EHV-1): characterization of a viralstrain isolated from equine plasma in Argentine. RevSci Tech Off Int Epiz 1989; 8,1:117-2211. Kawakami, Y. The genomic diversity amongequine herpesvirus-1 strains isolated in Japan. Ar-chives of Virology 1993; 129: 11-2212. Kirisawa, R.; UI, S.; Takahashi, A.; Kawakami,Y.; Iwai, H. Comparison of the genomes of attenu-ated equine herpesvirus-1 strains with their parentvirulent strain. Virology 1994; 200: 651-6013. Laemmli, V. Cleavage and structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophageT4. Nature 1970; 227: 680-514. Matumoto, M.; Ishizaki, R.; Shimizu, T. Sero-logical survey of equine rhinopneumonitis virus in-fections among horses in various countries. ArchGes Virusforsch 1965; 50: 606-2315. Meyer, H.; Hubert, P.H.; Eichhorn, W. Changesin restriction enzyme pattern of the Equine herpesvirus type 1 (EHV-1) strain Rac H DNA during at-tenuation. J Vet Med B 1987; 34: 310-1316. Nosetto, E.O.; Monina, M.I.; Baschar, H.; Galosi,C.M.; Gallo, G.; Idiart, J.R.; Gimeno, E,J. Síndromeneurológico asociado a herpes virus equino tipo 1(HVE-1). Med Vet 1985; 2: 583-817. Nowotny, N.; Burtscher, H.; Burki, F.Neuropathogenicity for suckling mice of Equine her-pesvirus 1 from the Lipizzan outbreak 1983 and ofselected other EHV 1 strains. J Vet Med B 1987; 34:441-818. Palfi, V.; Christensen, L.S. Analysis of restric-tion fragment patterns (RFPs) and pathogenicity inbaby mice of equine herpesvirus 1 and 4 (EHV-1 andEHV-4) strains circulating in Danish horses. Veteri-nary Microbiology 1995; 47: 199-20419. Patel, J.R.; Edington, N. The pathogenicity inmice of respiratory, abortion and paresis isolates ofequine herpesvirus-1. Veterinary Microbiology 1983;8: 301-520. Studdert, M.J.; Fitzpatrick, D.R.; Browning, G.F.;Cullinane, A.A.; Whalley, J.M. Equine herpesvirusgenomes: heterogeneity of naturally occurring type4 isolates and of a type 1 isolate after heterologouscell passage. Arch Virol 1986; 91: 375-8121. Turtinen, L.W.; Allen, G.P. Identification of theenvelope surface glycoproteins of equine herpesvi-rus type 1. J Gen Virol 1982; 63: 481-5

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Equine herpesvirus type 1 (EHV-1): restriction fragment patterns, polyacrylamide gel electrophoresis profiles and pathogenicity in baby mice

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