LRRK2 inhibitors as effective drugs for the treatment of neurodegenerative diseases

Abstract

218 p.-97 fig.-10 tab.El tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson entre otras, es uno de los grandes retos del siglo XXI. Esto se debe al gran número de pacientes afectados debido al aumento en la esperanza de vida. Se trata de enfermedades devastadoras en las que la calidad de vida de los enfermos empeora drásticamente. Asimismo, tienen un gran impacto social debido al gasto que suponen para la sanidad pública y las familias. Por todo ello, es de vital importancia encontrar nuevos fármacos eficaces que sean capaces de frenar el avance de estas enfermedades y no sólo de paliar los síntomas de las mismas. Este tipo de patologías se caracterizan por ser enfermedades multifactoriales en las que se ven implicados varios procesos biológicos. La etiología de estas enfermedades es aún desconocida pero se han descrito distintos eventos comunes a todas ellas entre los cuales destacan el estrés oxidativo, la neuroinflamación, la excitotixidad del glutamato y disrupciones en el proceso de plegamiento de las proteínas. La fase final en la biosíntesis de las proteínas corresponde a las modificaciones post-trasduccionales. Estas modificaciones post-transduccionales juegan un papel fundamental en el correcto plegamiento de las proteínas. Una de las más relevantes en la fisiología humana es la fosforilación. El proceso de fosforilación supone un equilibrio entre la función de diversas proteínas quinasas y las fosfatasas. Existen varias quinasas que fosforilan a diversas proteínas implicadas en los mecanismos de neurodegeneración. Una de éstas es la quinasa rica en repeticiones de leucina, LRRK2 (del inglés leucine-rich-repeat kinase 2). LRRK2 fue descubierta en 2002 y se ha convertido en una de las dianas más estudiadas en el campo de la enfermedad de Parkinson, ya que las mutaciones en el gen que codifica esta proteína son la primera causa genética de esta enfermedad. LRRK2 es una proteína compleja con siete dominios diferentes que ejerce una actividad tanto GTPasa como ATPasa. Sin embargo, el papel que juega esta enzima en diferentes vías de señalización neuropatológicas es más extenso y por tanto, podría jugar un papel importante en otras enfermedades neurodegenerativas. Por ello, nos planteamos como objetivo principal de ésta tesis estudiar el papel que juega LRRK2 fuera de la enfermedad de Parkinson mediante una estrategia de química genética. Para ello, en primer lugar y dado que no existe una estructura cristalográfica del dominio quinasa de LRRK2, se construyó un modelo de homología. Este modelo permitió el estudio del modo de unión de una familia de inhibidores de LRRK2 que ya había sido sintetizada en el grupo de investigación además de guiar el diseño de una nueva familia de inhibidores derivados de benzotiazol que ha sido sintetizada en este trabajo.De esta manera utilizando esta pequeña pero estructuralmente diversa colección de inhibidores de LRRK2, se ha podido estudiar en distintos modelos in vitro e in vivo, la implicación de este enzima en la neurogénesis en adulto, en la fosforilación de tau y en la retinosis pigmentaria. En relación a la activación de la neurogénesis en adulto que podría compensar la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades neurodegenerativas, se ha visto que algunos de los inhibidores actúan como moduladores positivos de la vía de señalización de Wnt (una de las principales vías neurogénicas) en un modelo que utiliza progenitores neuronales humanos obtenidos a partir de células pluripotenciales inducidas de adultos sanos. Asímismo, estos inhibidores con potencial neurogénico fueron probados in vitro en neuroesferas obtenidas a partir de la zona subventricular de ratones adultos y se comprobó que los mismos eran capaces de promover la proliferación de los progenitores neurales. Finalmente, los inhibidores más prometedores fueron estudiados en experimentos de diferenciación utilizando estas mismas neuroesferas y se pudo observar como algunos de ellos eran capaces de promover el linaje neuronal y fundamentalmente oligodendrocítico. Esta interesante actividad biológica de los inhibidores de LRRK2, hace pensar que este diana puede jugar un papel interesante en la esclerosis múltiple. Por otro lado, se decidió estudiar si la inhibición farmacológica de LRRK2 podría ejercer efecto en la fosforilación de tau. Esta hipótesis se basó en el hecho descrito sobre la fosforilación de tau in vitro como in vivo por LRRK2 tanto de una manera directa como indirecta. Para confirmar esta hipótesis, la quimioteca de inhibidores de LRRK2 se evaluó en un ensayo de neuroprotección desarrollado en este trabajo mediante el cual se induce neurotoxicidad por incremento de la fosoforilación de tau en células de neuroblastoma humano. Los inhibidores de LRRK2 demostraron tener un efecto neuroprotector en este modelo. Asímismo, estos compuestos fueron probados en un modelo celular de demencia fronto-temporal en el cual se utilizan neuronas glutamatérgicas obtenidas a partir de las células pluripotentes inducidas de un paciente afectado de esta enfermedad y portador de una mutación en el gen que codifica la proteína tau y que consecuentemente provoca la hiperfosforilación de la misma. Algunos inhibidores fueron capaces de reducir la fosforilación de tau en las dendritas así como la acumulación patológica de tau total en el soma de estas neuronas. En un siguiente paso, los compuestos más interesantes fueron probados en un segundo modelo celular de demencia fronto-temporal en el que a partir de las mismas células pluripotentes inducidas del mismo paciente se obtuvo un cultivo neuronal mixto en el que había neuronas dopaminérgicas, colinérgicas, glutamatérgicas y serotonérgicas, entre otras. En este segundo modelo se determinó cómo estos inhibidores de LRRK2 eran capaces de reducir la fosforilación de tau en distinto grado y medida en distintos epítopos. Un grupo reducido de estos inhibidores prometedores fueron probados en un modelo in vivo de Drosophila en el cual se expresa una forma humana mutada de la proteína tau en el ojo de la mosca.Consecuentemente se desencadena un fenotipo patológico en el ojo de esta. En un ensayo cualitativo se determinó cómo uno de los inhibidores de LRRK2 es capaz de revertir dicho fenotipo. Finalmente, uno de los inhibidores más prometedores fue probado en un modelo de tauopatía murino en el cual se induce la expresión de tau humana mutada en el lado ipsilateral del hipocampo. Con este modelo se determinó que el inhibidor es capaz de alcanzar el cerebro ya que se produce una bajada en los niveles de fosforilación de tau en el hipocampo, a la vez que una mejora de la cognición en estos animales. El último campo en el que se decidió estudiar el papel de LRRK2 fue en las degeneraciones retinianas, en concreto, la retinosis pigmentaria. Ya se había visto en el grupo que la glúcogeno-quinasa-3β (GSK3-β) juega un papel importante en este tipo de patologías y dado que LRRK2 está muy relacionada con la misma, se decidió estudiar si podría estar también implicada. En un primer lugar, se determinó que en un modelo de roedor de esta enfermedad (rd10), la expresión de LRRK2 aumenta a medida que avanza el proceso neurodegenerativo. En un segundo lugar, se estudió cómo en animales que habían sido tratados con uno de los inhibidores de LRRK2 había una tendencia a neuroproteger la capa de fotorreceptores así como una bajada importante de la neuroinflamación que se da en la retina como consecuencia de la enfermedad. Estos resultados abren un nuevo horizonte terapéutico para los inhibidores de LRRK2, ya que se muestra que esta enzima puede ser una diana interesante para promover la neurogénesis en adulto con una especial implicación en la esclerósis múltiple, en tauopatías y también en retinosis pigmentariaPeer reviewe