Leskoske, KL

Roelants, FM

Thorner, JW

eScholarship - University of California

UC BerkeleyUC Berkeley Previously Published WorksTitleNovel insights into regulation of Target of Rapamycin Complex 2 by hyperosmotic stress.Permalinkhttps://escholarship.org/uc/item/0t0886rmJournalMOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 27ISSN1059-1524AuthorsLeskoske, KLRoelants, FMThorner, JWPublication Date2016 Peer reviewedeScholarship.org Powered by the California Digital LibraryUniversity of California    POSTER PRESENTATIONS‐ TUESDAY P2188 Board Number: B1115 Suppressor of IKK epsilon (SIKE) links the cytoskeleton to innate immune signaling pathways. H.A. Sonnenschein1, F. Slykas1, K.F. Lawrence2, J.K. Bell1; 1Chemistry  Biochemistry Department, University of San Diego, San Diego, CA, 2Immunology  Microbiology Department, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA  Innate immunity coordinates the first line of defense against invading pathogen. Innate immune receptors signal production of pro‐inflammatory, anti‐viral, and apoptotic responses. Signals coalesce at catalytic hubs, such as kinases, to amplify downstream signaling and act as key sites of regulation. In the anti‐viral response, TANK binding kinase 1 (TBK1) functions as a catalytic hub. Suppressor of IKK epsilon (SIKE) was initially characterized as a negative regulator of TBK1‐mediated anti‐viral pathways. Subsequent study found SIKE acts as a high affinity, alternate TBK1 substrate, consistent with SIKE being phosphorylated upon viral infection. The goals of this project are to determine the function of SIKE and phosphorylated SIKE. The primary objective of this work was to examine the SIKE interaction network to infer SIKE function. Tandem MS/MS of immunoprecipitated FLAG‐tagged SIKE from transiently‐transfected cells revealed 27% of the SIKE interaction network consisted of actin and tubulin partners. Using confocal microscopy, endogenous SIKE was shown to strongly colocalize with actin, tubulin, alpha‐actinin and to a lesser extent ezrin, focal adhesion kinase, and beta‐catenin. Structured illumination microscopy showed that actin and alpha‐actinin maintained colocalization with SIKE. Reciprocal immunoprecipitation (RcIP) using GFP‐labeled actin or alpha‐actinin or DsRed‐tubulin with FLAG‐tagged SIKE from transiently transfect cells indicated that the SIKE:actin interaction was not maintained under these conditions. The SIKE:tubulin interaction appeared enhanced upon stimulation with dsRNA, a mimic of viral infection. The SIKE:alpha‐actinin interaction was neither disrupted nor enhanced by stimulation. To determine if cytoskeletal proteins interacted directly with SIKE, in vitro precipitations were completed using recombinant 6X‐His tagged SIKE and porcine tubulin (monomeric) or rabbit alpha‐actinin. Lysozyme served as a negative control for non‐specific binding to SIKE. SIKE:target were incubated at 1:0.5, 1:1 and 1:1.4 molar ratios, precipitated using Ni‐NTA resin, and eluted proteins assessed by SDS‐PAGE. SIKE:tubulin interactions were detected at all stoichiometries, whereas no SIKE:lysozyme interaction was observed. From these studies, 1) SIKE interacts with cytoskeletal proteins, 2) the SIKE:tubulin interaction may be sensitive to SIKE’s phosphorylation state, 3) the SIKE:alpha‐actinin interaction is unaffected by SIKE phosphorylation, and 4) the SIKE:tubulin interaction is direct. Together, these studies establish an interaction between SIKE and cytoskeletal proteins that may provide a direct link between innate immune signaling and cytoskeletal components. Work supported by NIH grant R21AI107447.  P2189 Board Number: B1116 Novel insights into regulation of Target of Rapamycin Complex 2 by hyperosmotic stress. K.L. Leskoske1, F.M. Roelants1, J.W. Thorner1; 1Department of Molecular  Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA  Target of Rapamycin (TOR) Complex 2 (TORC2) is a multi‐subunit protein kinase associated with the plasma membrane that is an essential regulator of growth. Ample genetic and biochemical evidence indicates that, in Saccharomyces cerevisiae, TORC2 exerts its effects solely via direct phosphorylation and upregulation of the activity of the downstream protein kinase Ypk1 (and its paralog Ypk2). TORC2‐Ypk1 signaling, in turn, regulates various aspects of the lipid composition and organization of the plasma     POSTER PRESENTATIONS‐ TUESDAY P2188 B ard Number: B1115 Suppressor of IKK epsilon (SIKE) links the cytoskeleton to innate immune signaling pathways. H.A. Sonn schein1, F. Slykas1, K.F. Lawrence2, J.K. Bell1; 1Chemistry  Biochemistry Department, University of San Diego, San Diego, CA, 2Immunology  Microbiology Department, Virginia Commonwealth University, Richmond, VA  I nate immunity coordinates the first line of defens  against invading pathogen. Innate immune receptors signal production of pro‐inflammatory, anti‐viral, and apo totic responses. Signals coalesce at catalytic hubs, such as kinases, to  mplify down tream signaling and act as key sites of regula ion. In the anti‐viral response, TANK binding kinase 1 (TBK1) functions as a catalytic hub. Suppressor of IKK epsilon (SIKE) was initially characterized as a negative regulator of TBK1‐mediated anti‐viral pathways. Subsequent study found SIKE acts as a high affinity, alternate TBK1 substrate, consistent with SIKE being phosphorylated upon viral infection. The goals of this project are to determine the function of SIKE and phosphorylated SIKE. The primary objective of this work was to examine the SIKE interaction network to infer SIKE function. Tandem MS/MS of immunoprecipitated FLAG‐tagged SIKE from transiently‐transfected cells revealed 27% of the SIKE interaction network consisted of actin and tubulin partners. Using confocal microscopy, endogenous SIKE was shown to strongly colocalize with actin, tubulin, alpha‐actinin and to a lesser extent ezrin, focal adhesion kinase, and beta‐catenin. Structured illumination microscopy showed that actin and alpha‐actinin maintained colocalization with SIKE. Reciprocal immunoprecipitation (RcIP) using GFP‐labeled actin or alpha‐actinin or DsRed‐tubulin with FLAG‐tagged SIKE from transiently transfect cells indicated that the SIKE:actin interaction was not maintained under these conditions. The SIKE:tubulin interaction appeared enhanced upon stimulation with dsRNA, a mimic of viral infection. The SIKE:alpha‐actinin interaction was neither disrupted nor enhanced by stimulation. To determine if cytoskeletal proteins interacted directly with SIKE, in vitro precipitations were completed using recombinant 6X‐His tagged SIKE and porcine tubulin (monomeric) or rabbit alpha‐actinin. Lysozyme served as a negative control for non‐specific binding to SIKE. SIKE:target were incubated at 1:0.5, 1:1 and 1:1.4 molar ratios, precipitated using Ni‐NTA resin, and eluted proteins assessed by SDS‐PAGE. SIKE:tubulin interactions were detected at all stoichiometries, whereas no SIKE:lysozyme interaction was observed. From these studies, 1) SIKE interacts with cytoskeletal proteins, 2) the SIKE:tubulin interaction may be sensitive to SIKE’s phosphorylation state, 3) the SIKE:alpha‐actinin interaction is unaffected by SIKE phosphorylation, and 4) the SIKE:tubulin interaction is direct. Together, these studies establish an interaction between SIKE and cytoskeletal proteins that may provide a direct link between innate immune signaling and cytoskeletal components. Work supported by NIH grant R21AI107447.  P2189 Board Number: B1116 Novel insights into regulation of Target of Rapamycin Complex 2 by hyperosmotic stress. K.L. Leskoske1, F.M. Roelants1, J.W. Thorner1; 1Department of Molecular  Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA  Target of Rapamycin (TOR) Complex 2 (TORC2) is a multi‐subunit protein kinase associated with the plasma membrane that is an essential regulator of growth. Ample genetic and biochemical evidence indicates that, in Saccharomyces cerevisiae, TORC2 exerts its effects solely via direct phosphorylation and upregulation of the activity of the downstream protein kinase Ypk1 (and its paralog Ypk2). TORC2‐Ypk1 signaling, in turn, regulates various aspects of the lipid composition and organization of the plasma     POSTER PRESENTATIONS‐ TUESDAY membrane during normal cell growth. In addition, TORC2 activity, and thus Ypk1 function, is modulated by environmental insults that exert stress on the plasma membrane. Ypk1 action maintains plasma membrane homeostasis in multiple ways. For example, in response to sphingolipid depletion, TORC2 activates Ypk1, which then phosphorylates targets that stimulate sphingolipid synthesis, inhibit aminoglycero‐phospholipid flipping, and block endocytosis of integral plasma membrane proteins. In contrast, in response to hyperosmotic shock, TORC2 stimulation of Ypk1 is rapidly lost, alleviating Ypk1‐mediated inhibition of Gpd1‐dependent glycerol production and preventing Ypk1‐mediated opening of the aquaglyceroporin Fps1, thereby allowing cells to rapidly accumulate intracellular glycerol to counteract the increase in extracellular tonicity. How hypertonic conditions influence TORC2 is not well understood. We report here that the plasma me brane‐localized osmosensor Sln1 is an upstream regulator of TORC2. Inactivation of Sln1, as occurs under hyperosmotic conditions, leads to loss of TORC2 phosphorylation of Ypk1. Upon Sln1 inactivation, the TORC2 subunit Avo2 is phosphorylated at its MAPK phosphoacceptor sites. This response requires two mitogen (messenger)‐activated protein kinases (MAPKs), Hog1 and Slt2/Mpk1. Absence of Avo2 partially restores TORC2‐mediated stimulation of Ypk1 under hyperosmotic conditions. These results suggest that the phosphorylation status of the Avo2 subunit of TORC2 serves as a rheostat for controlling TORC2 function.  P2190 Board Number: B1117 Novel approach for rapid development  f optimized FRET‐based biosensor for signaling network interrogation in cellulo and i  vivo. F. Sipie er1,2, B. Cappe1,2, O.C. Gavet3, L. Helio 4, P. Vandenabeele1,2, P. Vincent5, F.B. Riquet1,2,6; 1Molecular Signaling and Cell Death Unit, D partment of Bi medic l M lecular Biolog , Ghent University, Ghe t, Belgium, 2Molecular Signaling and Cell Death Unit, Inflammation Research Center (IRC), a VIB‐UGent department, VIB, Ghent, Belgium, 3Institut Gustave Roussy (IGR), CNRS‐UMR 8200, CNRS/Paris‐Sud University, Villejuif, France, 4Team Biophotonique Cellulaire Fonctionnelle, Laboratoire de Physique des Lasers, Atomes et Molécules (PhLAM), CNRS UMR 8523, CNRS/Lille1 University, Villeneuve d’Ascq, France, 5Neurobiologie des processus adaptatifs (NPA), CNRS UMR 7102, CNRS / UPMC Paris 6, Paris, France, 6Structural and Functional Glycobiology Unit (UGSF), CNRS UMR 8576, Lille 1 University, Villeneuv  d’A cq, France  Towards comprehensive understanding of molecular signaling regulation at the single living cells level, bios nsors provide a read‐out of biochemical events with a high spatiotemporal resolution. However, the recording of biochemical  vents during unperturbed cellular processes is challenged by biosensor sensitivity. To alleviate the problem, we propose a validated approach to accelerate the developme t for highly sensitive geneti ally encod  FRET biosensors. Considering the importance of kinases in the regulation of biological processes, we decided to focus on genetically encoded FRET‐based Kinase Activity Reporters (KARs). i) Driven by flexibility and versatility to produce tailor‐made KARs, ii) taking into account the number of potential kinase substrates to be tested, and iii) the existence of several different Phospho Amino Acid Binding Domain (PAABD) and the many fluorescent protein variants available, we reasoned that Gateway cloning method would be advantageous. The positive outcome of our proof of principle study performed on the Protein kinase A biosensor (AKAR3‐EV), prompted us to engineer the four necessary plasmid libraries flanking N‐terminal and C‐terminal fluorescent proteins, substrate domains, and PAABD. We then tested our approach on reporters of PKA (AKAR3‐EV) and Extracellular signal Regulated Kinases 1&2 (ERK1/2 ‐ EKAR‐EV) activities We confirmed that the recombination sequences do act as short linkers flanking each functional elements of the biosensor providing enhanced biosensor reversibility. While biosensor validation conducted in different cellular MOLECULAR	  BIOLOGY	  OF	  THE	  CELL	  Volume:	  27	  	  	  	  Mee8ng	  Abstract:	  P2189	  Published:	  	  2016	  

Novel insights into regulation of Target of Rapamycin Complex 2 by hyperosmotic stress.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

eScholarship - University of California