Evaluation of drug effects regarding novel metal-based as well as natural anticancer compounds by means of bottom-up label-free LC-MS/MS-based proteome profiling

Abstract

Für die Entwicklung eines Wirkstoffes und dessen klinische Anwendung ist ein besseres Verständnis seiner zellulären Targets und Wirkungsweise von enormer Bedeutung. Die derzeit eingesetzten phänotypischen Analysemethoden für Zellzyklus, Viabilität und Zelltod haben sich bewährt, liefern allerdings wenig Informationen über globale Effekte auf molekularer Ebene. Proteine werden zunehmend als Wirkstofftargets identifiziert und aufgrund ihrer Schlüsselfunktionen in zellulären Abläufen, weisen sie großes Potential für die Aufklärung von Wirkmechanismen auf. Deshalb wurde eine auf Flüssigchromatographie (LC) und Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) basierende Label-freie Proteomanalysemethode herangezogen, um Unterschiede in Proteinabundanzen zwischen mit Medikamenten behandelten und unbehandelten Zellen zu evaluieren. In verschiedenen Zellkuturmodellen wurden die Effekte von (i) den Metall-basierenden Antikrebswirkstoffen As¬¬2O3, KP46 (Gallium), KP772 (Lanthan), NKP-1339 (Ruthenium) und KP1537 (Platin) sowie (ii) dem natürlich vorkommenden Biphenol Kurkumin untersucht. Colonkarzinomzellen wurden mit den Metallverbindungen behandelt und anschließend in Zytoplasma und Krenextrakt fraktioniert, um einen tieferen Einblick in die stattfindenden regulatorischen Prozesse zu erhalten. Zur besseren Repräsentation der in vivo Situation, wurden Kurkumineffekte in Co-Kulturmodellen von Brustkrebszellen mit Krebsassoziierten-Fibroblasten untersucht. Hierfür wurden Gesamtzelllysate analysiert. Insgesamt wurden 5525 beziehungsweise 5780 Proteingruppen in den enzymatisch verdauten Colonkarzinom- und Brustkrebsproben mittels LC-MS/MS identifiziert. Die basalen Proteinkonzentrationen variierten stark zwischen den verschiedenen Zellen, auch wenn sie von dem gleichen Gewebe stammten, wodurch Proteinregulationen durch Wirkstoffbehandlungen entscheidend beeinflusst werden können. Die Untersuchungen der Effekte der Metallverbindungen auf das Proteom ermöglichten die Generierung von Hypothesen bezüglich ihrer Wirkmechanismen, die bis dahin unbekannt waren. Die Proteomanalysen der Kurkumineffekte zeigten, dass die Reaktion auf einen Wirkstoff stark kontextabhängig ist und die Tumormikroumgebung einen massiven Einfluss darauf ausübt. Die Ergebnisse dieser Dissertation könnten zu einer Verbesserung des Wirkstoffevaluierungsprozesses und von Patientenstratifizierungsstrategien führen.A better understanding of drug targets and the underlying modes of action are of great importance for drug development and application in clinical practice. The traditionally employed and well established phenotypic assays for cell cycle, viability and death analysis give little information about global effects on a molecular basis. Proteins are increasingly identified as drug targets and hold great potential for the elucidation of modes of action since they are the active players within cell, responsible for cellular fate and function. Therefore, a label-free quantification proteomics approach based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was employed to evaluate protein abundances in treated and untreated cells, i.e. response profiling. Drug effects were investigated in different cell culture models by response profiling of (i) the metal-based anticancer drugs As¬¬2O3, KP46 (gallium), KP772 (lanthanum), NKP-1339 (ruthenium) and KP1537 (platinum) and (ii) the naturally occurring biphenol curcumin. Colon carcinoma cells were exposed to the metallodrugs and subsequently fractionated into cytoplasmic and nuclear extracts to gain a deeper insight into the regulatory effects. For a better representation of the in vivo situation, investigations on curcumin effects executed not only with single cell type cultures but also with tumor-stroma co-culture models of breast cancer and cancer-associated fibroblast-like cells. Whole cell lysates were obtained for this study. Overall, 5525 and 5780 protein groups were identified by LC-MS/MS analysis of in-solution digested colon and breast cancer samples, respectively. Remarkably great differences of basal protein abundances were observed in the diverse cells, even if they derived from the same tissue. This circumstance may substantially affect protein regulations upon drug exposure. Global effects of the investigated metallodrugs on the proteome were characterized and hypotheses on hitherto unrecognized mechanisms were generated. Response profiling of curcumin demonstrated strong context-dependent effects, emphasizing the massive contribution of the microenvironment to drug responses. The findings of this thesis might contribute to the improvement of drug evaluation as well as patient stratification strategies