Mestrado em Biologia Molecular CelularA síntese de proteínas de acordo com o código genético é essencial para
manter proteoma estável e para a homeostase celular. No entanto, os erros
podem ocorrer naturalmente durante a síntese da proteína a partir do seu
mRNA, variando entre 10-3 a 10-4 erros por codão. Estes erros ocorrem com
mais frequncia em proteínas recombinantes sobre-expressas em hospedeiros
heterólogos. Quantidades crescentes de proteína não-funcional estão
geralmente relacionados à tradução em condições de stress. Neste estudo
utilizou-se Saccharomyces cerevisiae como um organismo hospedeiro para
expressar o gene lacZ-GST para quantificar o erro de tradução. A levedura foi
tratada com diversos agentes de stress tais como o etanol, o crómio (CrO3), e
aminoglicósido antibiótico - geneticina (G418). A incorporação de erros foi
estudada em proteína solúvel e insolúvel para determiner se os erros de
tradução aumentam a agregação de proteína. Usando esta abordagem,
verificou-se que o stress aumenta o erro de tradução para níveis de 5.6 × 10-3
a 8 × 10-3, 60 - 80 vezes mais que o nível normal. Esta taxa de erro
inesperadamente elevada tem implicações para a utilização terapêutica de
proteínas recombinantes.The synthesis of protein according to genetic code of a gene determines the
basis of life and a stable proteome is necessary for cell homeostatis. Faithful
translation of protein give gurantee of cell survival. However, errors occur
naturally during translation of protein from its mRNA, which varies from 10-3 to
10-4 per codon. These errors are more frequent in recombinant protein
overexpressed in heterologous hosts and affect protein functionality. The
increasing amount of nonfunctional protein is often related to mistranslation of a
gene under stress. In the present study, we used Saccharomyces cerevisiae as
a host organism to overexpress E. coli lacZ gene fusion with GST to quantify
misincorporation of amino acid in GST-β galactosidase recombinant protein.
The yeast was treated with various stressors such as ethanol, chromium
(CrO3), and aminoglycoside antibiotic - geneticin (G418) to induce protein
aggregation. The misincorporation of amino acids was studied in both soluble
and insoluble protein fractions by mass-spectrometry to determine how much
misincorporation occur and whether this is associated with protein insolubility.
We found that under experimental stress conditions the misincorporation of
amino acids ranges from 5.6 × 10-3 to 8 × 10-3, which represents 60-80 fold
higher than reported level. The unexpectedly high error rate has implications for
the therapeutic use of the heterologous host derived recombinant proteins
