Mecanisme d'acció del nou fàrmac antitumoral ARTL0812: rol de la pseudoquinasa TRIB3, l'estrès reticular i els esfingolípids en la mort mediada per autofàgia

Abstract

L'ABTL0812 és un derivat lipídic amb activitat antitumoral llicenciat per la companyia biofarmacèutica Ability Pharmaceuticals. En estudis preliminars es va observar que l'ABTL0812 indueix citotoxicitat en un ampli espectre de cèl·lules tumorals humanes i una inhibició del creixement de tumors xenografts derivats de cèl·lules tumorals humanes, propietats que han motivat el seu desenvolupament pre-clínic. A l'actualitat, l'ABTL0812 es troba en Fase Clínica 2 en pacients amb càncer de pulmó escamós i d'endometri avançat (identificador ClinicalTrials.gov: NCT03366480). El nostre laboratori està implicat en caracteritzar el seu mecanisme d'acció antitumoral, utilitzant com a model les cèl·lules MiaPaca2 (adenocarcinoma pancreàtic) i A549 (adenocarcinoma de pulmó). Estudis previs realitzats al laboratori mostren que l'ABTL0812 activa els receptors PPAR i PPAR, que medien en la inducció de mort dependent d'autofàgia sense induir l'aparició de trets típicament apoptòtics. En aquesta Tesi Doctoral, mitjançant assajos de gen reporter luciferasa, quantificació de mRNA per RT-qPCR i assaig d'immunoblot, demostrem que l'activació dels receptors PPAR/ indueix l'activació transcripcional de la pseudoquinasa TRIB3. Una vegada sobre-expressada, TRIB3 uneix Akt i impedeix la seva activació per les quinases activadores PDK1 i mTORC2. Com a conseqüència d'això, s'inhibeix el complex mTORC1. Tanmateix, s'ha constatat que la inhibició del complex mTORC1 a les cèl·lules tumorals humanes MiaPaca2 i A549 no és suficient per induir una autofàgia robusta anàloga a l'observada per l'ABTL0812. Aquest fet va motivar l'estudi sobre si l'estrès reticular podia estar relacionat amb la sobre-expressió de TRIB3 i la mort cel·lular mediada per autofàgia induïdes per l'ABTL0812, tal com s'ha proposat per altres composts anti-tumorals com el tetrahidrocannabinol. En aquest treball hem observat que l'ABTL0812 indueix dilatació del reticle endoplasmàtic i la sobre-expressió dels marcadors d'estrès reticular BiP, ATF4 i CHOP. En conjunt, aquests resultats demostren la inducció d'estrès reticular per part de l'ABTL0812. El bloqueig farmacològic de l'estrès reticular mostra preliminarment que l'estrès reticular media en la citotoxicitat induïda per l'ABTL0812. D'interès, s'ha posat a punt la quantificació dels nivells de mRNA plasmàtics dels marcador d'estrès reticular CHOP i TRIB3, tant en mostres de sang total com a PBMCs purificades, i s'ha constatat que augmenten en els pacients humans en resposta al tractament amb ABTL0812. En l'actualitat, aquests biomarcadors farmacodinàmics s'estan utilitzant a la Fase Clínica 2. L'anàlisi per espectrometria de masses de l'esfingolipidoma de cèl·lules tumorals ha permès observar que l'ABTL0812 indueix l'acumulació de dihidroceramides de cadena llarga, sense alterar els nivells de ceramides. Aquest esdeveniment s'explica pel fet que la incubació amb ABTL0812 resulta en la inhibició de l'enzim desaturasa-1 (Des-1) a la cèl·lula tumoral. Des-1 és l'últim enzim de la via de síntesi de novo de ceramides (catalitza el pas de dihidroceramides a ceramides) i la seva inhibició resulta en l'acumulació de dihidroceramides de cadena llarga, de manera anàloga a la mostrada per l'inhibidor específic de Des-1 GT11. D'interès, el tractament de les cèl·lules tumorals amb la dihidroceramida de cadena curta dideuterada d2c8DhCer (que provoca un augment dels nivells cel·lulars de dihidroceramides) resulta en la inducció d'estrès reticular, autofàgia i citotoxicitat a les cèl·lules tumorals MiaPaca2 i A549, tal com fa l'ABTL0812. L'estudi preliminar dels processos executors de la mort cel·lular induïda per l'ABTL0812 mostra que aquest compost altera la funció mitocondrial (depleció dràstica d'ATP cel·lular) i activa la via canònica de mitofàgia PINK1/parkina/ubiquitina. A més a més, l'ABTL0812 promou l'alliberació citosòlica de catepsines lisosomals, suggerint la inducció de permeabilització de membrana lisosomal (LMP) que explicaria la mort per necrosi observada a les cèl·lules tumorals. Finalment, aquesta Tesi proposa que l'ABTL0812 actuaria de forma paral·lela a través de dos eixos. Per un costat, activaria els receptors PPAR/, que indueixen la sobre-expressió de TRIB3 i la subseqüent inhibició d'Akt i del complex mTORC1. Per l'altre costat, l'ABTL0812 inhibiria l'enzim Des-1, provocant una acumulació de dihidroceramides de cadena llarga i l'activació d'estrès reticular. Ambdós eixos del mecanisme sinergitzen en l'activació d'autofàgia robusta i mort cel·lular, com demostra el tractament combinat amb l'inhibidor específic de mTORC1 Everolimus i l'inhibidor específic de Des-1 GT11.ABTL0812 is a polyunsaturated fatty acid derivative with antitumoral activity licensed by the biopharmaceutical company Ability Pharmaceuticals. ABTL0812 shows cytotoxicity in a wide panel of human tumor cell lines and induces tumor growth inhibition in human tumor cell-derived xenografts. This have encouraged its pre-clinical and clinical development. ABTL0812 recently started Phase 2 Clinical trials in patients with advanced endometrial cancer and squamous NSCLC, as a first line of treatment in combination with paclitaxel and carboplatin (ClinicalTrials.gov: NCT03366480). Our laboratory is involved in the characterization of ABTL0812's antitumoral mechanism of action, using MiPaca2 (pancreatic adenocarcinoma) and A549 (lung adenocarcinoma) cell lines as models. Previous studies carried out in our laboratory uncovered that in cells ABTL0812 activates peroxisome proliferator-activated receptors PPAR/ receptors, inducing autophagy-mediated cancer cell death without activating apoptosis. Here, by using gene reporter luciferase assay, qRT-PCR mRNA quantification and immunoblot analysis, we show that ABTL0812 activates PPAR-mediated transcription of Tribbles 3 (TRIB3) pseudokinase. Over-expressed TRIB3 then binds and inhibits Akt, preventing its activation by PDK1 and mTORC2 upstream kinases, resulting in inhibition of the oncogenic Akt/mTORC1 axis. However, we found that mTORC1 inhibition is not enough to induce robust autophagy in MiaPaca2 and A549 cell lines, as it does ABTL0812. Thus, we investigated whether endoplasmic reticulum (ER) stress could also account for ABTL0812-induced TRIB3 overexpression, as it has been proposed for other antitumoral drugs such as tetrahydrocannabinol. We found ABTL0812 induces endoplasmic reticulum dilatation and over-expression of the endoplasmic reticulum stress markers BiP, ATF4 and CHOP (both mRNA and protein levels), indicating that ABTL0812 induces ER stress in these tumor cells. We also show preliminary pharmacological data suggesting that ER stress has a role in mediating ABTL0812-induced cytotoxicity. Remarkably, we have optimized a protocol for the quantification of TRIB3 and CHOP mRNAs (qRT-PCR) in blood and purified PBMCs from patients enrolled in Clinical Phase 2. We describe increased levels of CHOP and TRIB3 mRNAs in response to ABTL0812 treatment. Furthermore, we have proposed and optimized RT quantification of the ER stress genes TRIB3 and CHOP as reliable pharmacodynamic biomarkers for the ongoing Phase 2 Clinical trials. Given the role of sphingolipids in initiating the ER stress, we undertook a comprehensive mass-spec analysis of cellular sphingolipids to show that ABTL0812 induces long-chain dihydroceramides accumulation without affecting ceramide levels. In cells, dihydroceramides are converted into ceramides by the desaturase-1 (Des-1) enzyme. Enzymatic analysis demonstrated that ABTL0812 treatment results in inhibition of Des-1 activity in vitro and in cellular assays, provoking an accumulation of long-chain dihydroceramides, analogously to that induced by Des-1 specific inhibitor GT11. Interestingly, we show that treatment with the dideuterated short-chain dihydroceramide d2c8DhCer (which induces an increase of cellular dihydroceramides) results in endoplasmic reticulum stress, autophagy and cytotoxicity in MiaPaca2 and A549 cell lines. Preliminary characterization of ABTL0812-induced cell death shows that this compound alters mitochondrial function (induces a drastic depletion of cellular ATP) and it activates the canonic mitophagy pathway PINK1/parkin/ubiquitin. Furthermore, ABTL0812 induces cytosolic release lysosomal cathepsin B, suggesting a lysosomal membrane permeabilization (LMP) that would explain the necrotic cell death observed in tumor cells. Finally, this work proposes that ABTL0812 exerts its antitumoral activity acting simultaneously on two axes. On one hand, ABTL0812 activates PPAR/ receptors, which induce TRIB3 over-expression and the subsequent Akt and mTORC1 inhibition. On the other hand, ABTL0812 inhibits Des-1 enzyme, resulting in accumulation of long-chain dihydroceramides and the subsequent activation of ER stress. Both axes synergize to activate a robust autophagy which ultimately leads to lysosomal membrane permeabilization and necrosis. In agreement with this, we show that the inhibition of mTORC1 (Everolimus) synergizes with Des-1 inhibition (GT11) to promote autophagy and cytotoxicity