内容の要旨 , 審査の要旨広島大学(Hiroshima University)博士(歯学)Doctor of Philosophy in Dental Sciencedoctora

Hoshino, Hiroaki

内容の要旨 , 審査の要旨博士(歯学)Doctor of Philosophy in Dental Science広島大

Hiroshima University Institutional Repository

 第 6号様式  論 文 審 査 の 要 旨  博士の専攻分野の名称 博 士 （ 歯 学 ） 氏名      星野 博昭 学位授与の要件 学位規則第４条第１・２項該当  論 文 題 目  新規 long non-coding RNA による Dentin matrix protein-1 遺伝子発現制御機構の解析   論文審査担当者 主  査    宿南 知佐  教授                 印 審査委員    香西 克之  教授                          審査委員    宮内 睦美  准教授                          〔論文審査の要旨〕   近年,ヒトやマウスの大規模なゲノム解析が進み,これまで意味のないとされてきた非遺伝子座領域中のゲノム配列において,タンパク質を翻訳しない non-coding RNA(ncRNA)が転写されることが明らかとなってきた。その中でも,long ncRNA(lncRNA)は一般的に 200塩基以上の長さを持つものと定義され,数十塩基の micro RNA 等とは区別される。lncRNA のゲノム上での局在,総数および各種組織や細胞での発現パターンは未だ十分に解明されていないものの,局所のクロマチンリモデリングに関与してその近傍遺伝子の発現を調節するlncRNAの存在が示されている。Dentin matrix protein-1(DMP-1)は分泌性タンパク質で,in vitro では歯髄細胞の分化誘導時に発現誘導され,in vivo では象牙質の形成・成熟に必須の役割を担っている。しかし,DMP-1 を恒常的に高発現している細胞株は少なく,その制御機構は未だ十分に解明されていない。そこで本研究では,lncRNA による DMP-1 発現制御機構を明らかにするために,DMP-1 を高発現する細胞株を探索し,見出した細胞株の DMP-1 転写調節領域において,lncRNAの探索・同定およびその機能解析を行った。[材料および方法] 1. 各種細胞株における DMP-1発現量の検討：ヒト骨肉腫由来細胞株および口腔癌由来細胞株 12種類を低血清培地で 24時間培養した後,細胞培養上清および細胞溶解液を回収した。得られたタンパク質溶液を SDS-PAGEに展開し,抗 DMP-1抗体を用いた Western blottingによって DMP-1発現を検討した。さらに,DMP-1の細胞質内局在を免疫蛍光染色にて解析した。また,同様に培養した各種細胞株から total RNA を抽出し,合成した cDNAを用いて quantitative PCR(qPCR)を行った。2. DMP-1 転写調節領域付近における lncRNA の探索：① PCRスクリーニング; DMP-1転写調節領域付近に約 100 bp を増幅させるようにランダムに作製した複数の primer pairsを用いて qPCRを行った。② in vivoでの DMP-1および新規 RNA 発現量の検討; TissueScan™ Cancer and Normal Tissue cDNA Arrays(ORIGENE 社)を用いて,48種類の頭頸部癌組織において DMP-1および新規 RNAの発現を qPCRにて解析した。③ 新規 RNAの全長クローニング; qPCRにて増幅が見られた領域を起点に,RACEにて新規 RNA の 5’および 3’末端を同定し,全長 RNA を決定した。3. DMP-1 と lncRNA の相互依存的遺伝子発現の検討：① DMP-1および lncRNA発現抑制による相互依存性の検討; DMP-1および lncRNAに特異的な siRNAを作製し,歯肉癌由来細胞株に遺伝子導入した。48時間培養した後に total RNA を抽出し,DMP-1 および lncRNA 発現変化を qPCR にて解析した。② DMP-1および lncRNA 発現抑制による RNA分解速度への影響の検討; 上記同様、歯肉癌細胞株にそれぞれの siRNAを遺伝子導入し,48時間培養した後にα-Amanitin試薬を添加した。その後,3時間おきに total RNAを抽出し,DMP-1および lncRNA発現変化を qPCRにて解析した。③ DMP-1 と lncRNA の直接的会合の検討; In vitro translation によって作製したビオチン化 DMP-1 を歯肉癌由来細胞株の細胞溶解液と混和した後に,ストレプトアビジンビーズによる RNA pull down によってビオチン化 DMP-1 に直接会合する lncRNA 量を qPCR にて検討した。4. DMP-1および lncRNA発現抑制による細胞増殖への影響の検討：上記同様、各種細胞株にそれぞれの siRNAを遺伝子導入し,48時間培養した後に Crystal violet染色にて細胞数を比較した。[結果] qPCR,Western blotting,免疫蛍光染色による検討から,ヒト口腔癌由来細胞株に DMP-1が高発現していることを見出した。また,PCRスクリーニングによって,DMP-1 転写調節領域付近に新規 RNA が存在することを明らかとし,in vitro および in vivo両解析結果から,DMP-1および新規 RNAの発現量には高い正の相関関係があることが明らかとなった。そして,RACE によって DMP-１転写開始領域上流の antisense 鎖に3,442塩基数を有する新規 lncRNAを同定した。さらに,siRNA導入発現抑制による相互依存性,α-Amanitin 試薬による RNA 分解速度,ならびに RNA pull down による直接会合の検討の結果,lncRNAは DMP-1 5’UTRを介して DMP-1と相補的に結合していることが示唆された。加えて Crystal violet 染色による細胞増殖への影響の検討によって,DMP-1 および lncRNA発現抑制依存性に口腔癌由来細胞株の細胞数が減少した。[結論および考察] DMP-1高発現細胞株の DMP-１転写開始領域上流に新規 lncRNAを同定した。この lncRNAは DMP-1との直接会合によって DMP-1発現を制御することが明らかとなった。以上の結果から,本研究によって DMP-1および lncRNA発現の制御、あるいは DMP-1と lncRNAの会合の制御が,口腔癌治療薬開発の標的として有用である可能性が示唆された。また,DMP-1を高発現する終末分化した骨細胞・象牙芽細胞においても同様の発現調整メカニズムが存在すると考えられることから,この lncRNAは硬組織再生に関わる候補因子であることが推定された。  よって審査委員会委員全員は，本論文が著者に博士（歯学）の学位を授与するに十分な価値あるものと認めた。  

新規 long non-coding RNA によるDentin matrix protein-1遺伝子発現制御機構の解析

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