GENETIC ENGINEERING OF PSEUDOMONAS PUTIDA TO BROADEN ITS METABOLIC CAPACITIES TOWARD GUAIACOL, A LIGNIN-RELATED AROMATIC COMPOUND

Abstract

GENMANIPULATION AV PSEUDOMONAS PUTIDA BREDDNING AV DESS METABOLISKA KAPACITET MOT GUAIACOL, EN LIGNINGRELATERADE AROMATISK FÖRENING LISE-LOTTE KURÉ Kuré L, Genmanipulation av Pseudomonas putida- Breddning av dess metaboliska kapacitet mot guajakol, en ligninrelaterad aromatisk förening. Examensarbete 15 högskolepoäng, Malmö universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för Biomedicinsk Vetenskap, 2018. Abstrakt: Lignin är en cellväggskomponent hos växter och utgör näst efter cellulosa den mest förekommande organiska föreningen i naturen. Dess struktur är extremt komplex och utgörs av aromatiska monomerer. Detta gör lignin mycket attraktivt för miljövänlig kemikalietillverkning. Trots detta utnyttjas inte lignin på en industriell nivå på grund av dess komplexa heterogena struktur. Industrin har inte lyckats lösa problematiken med ligninets heterogenitet som genererar orena produkter i en bransch där renhet är av stor vikt. Bakterier tros dock kunna utnyttja och producera värdefulla och rena produkter ur lignin. Pseudomonas putida KT2440 har visat sig kunna använd och växa i många olika ligninrelaterade aromatiska monomerer, och är således en god kandidat för bioproduktion. Dock kan bakterien inte utnyttja den vanligt förekommande monomeren guajakol. Bakterien saknar det enzym som krävs för att guajakol ska demetyleras till katekol, som därefter utnyttjas som kolkälla för tillväxt. Däremot har vissa bakterier visat på denna typ av aktivitet via enzymet Cytokrom P450. På grund av dess egenskaper är det önskvärt att behålla den förbättrade versionen P. putida EM42 som värd. Syftet med projektet är att integrera gener som kodar för Cytokrom P450 i P. putida EM42 för att få den att växa på och utnyttja guajakol som enda kolkälla. Gener från sex bakterier som kodar för enzymet klipptes ut med restriktionsenzymer, amplifierades med PCR och ligerades i plasmid pSEVA424. Därefter transformerades de rekombinanta plasmiderna in i P. putida EM42 genom elektroporering. Restriktions- och sekvensanalyser utfördes innan korrekta transformanter odlades på M9-medium och guajakol. Proverna sändes till UHPLC- analys, där ingen konsumtion av guajakol detekterades. Då ingen tillväxt kunde urskiljas utfördes SDS-PAGE proteinanalys, även denna med negativt resultat. Slutsatsen är att trots utan tillväxt är detta ett framgångsrikt första steg i ett bredare arbete som kommer att ta längre tid att uppnå. Konstruktionerna i detta projekt kommer att användas för fortsatta studier, med syfte att samla alla delar som är inblandade i demetyleringen av guajakol. Nyckelord: Aromatiska monomerer, Cytokrom P450, guajakol, lignin valorisering, Pseudomonas putidaGENETIC ENGINEERING OF PSEUDOMONAS PUTIDA TO BROADEN ITS METABOLIC CAPACITIES TOWARD GUAIACOL, A LIGNIN-RELATED AROMATIC COMPOUND LISE-LOTTE KURÉ Kuré L, Genetic engineering of Pseudomonas putida- To broaden its capacities towards guaiacol, a lignin related aromatic compound. Bachelor thesis 15 credits, Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical Science, 2018. Abstract: Lignin is a cell wall component of plants and is next to cellulose the most abundant biopolymer in nature. It has a complex structure and consist of aromatic monomers. This makes lignin very attractive as a source of environmentally friendly chemical manufacturing. Despite this, lignin is scarcely used at an industrial scale because the industry has not managed to solve the problem of lignin depolymerization, which results in heterogeneous products in an industry where purity is of immense importance. However, bacteria show promising results in the production of valuable and clean products from lignin. Pseudomonas putida KT2440 has been shown to grow and exploit many different lignin related aromatic monomers and is thus a suitable candidate for bio-production. However, it cannot use the unaddressed monomer guaiacol. The bacterium lacks the enzyme required for guaiacol demethylation into catechol, which is then used as carbon source. However, some bacteria have shown this type of activity via a Cytochrome P450 enzyme. Because of its traits it is desirable to use the improved version P. putida EM42 as a chassis. The aim of the project is to integrate genes coding for Cytochrome P450 in P. putida EM42, enabling it to grow on guaiacol as the only carbon source. Genes from six bacteria coding for the enzyme were cut out with restrictions enzymes, amplified by PCR and ligated in plasmid pSEVA424. The recombinant plasmids were transformed into P. putida EM42 by electroporation. Restriction- and sequence analyses were performed before the correct transformants were grown on M9 medium and guaiacol. The samples were sent to UHPLC analysis, where no consumption of guaiacol was detected. As no growth could be discerned, SDS-PAGE protein analysis was performed, also with negative results. The conclusion is that, despite no growth this is a successful first step in a broader work frame that will take further time to achieve. The constructs in this work will be used for further studies, with the purpose of assembling all the elements involved in the demethylation of guaiacol. Keywords: Aromatic monomers, Cytochrome P450, Lignin, guaiacol, Pseudomonas putida EM42, valorisation