La spectroscopie Raman est un outil puissant d'analyse de la composition moléculaire d'échantillons biologiques. La complexité de certains tissus rend l'analyse des spectres tributaire de méthodes d'extraction des informations pertinentes. L'Analyse en Composantes Indépendantes est montrée comme un outil efficace de séparation des spectres à condition que des prétraitements adaptés et développés dans ce papier soient appliqués afin de linéariser le modèle génératif des spectres déformés par l'instrumentation

GOBINET, Cyril

HUEZ, Régis

PERRIN, Eric

VRABIE, Valeriu

I-Revues

De l’importance des traitements pre´alables a` l’application de
l’Analyse en Composantes Inde´pendantes en spectroscopie
Raman
Cyril Gobinet1, Valeriu Vrabie2, E´ric Perrin2, Re´gis Huez2
1Unite´ Me´DIAN, UMR CNRS 6142, Universite´ de Reims Champagne-Ardenne
51 rue Cognacq-Jay, 51096 Reims Cedex
2CReSTIC, Universite´ de Reims Champagne-Ardenne
Chausse´e du Port, 51000 Chaˆlons-en-Champagne
cyril.gobinet@univ-reims.fr, valeriu.vrabie@univ-reims.fr
eric.perrin@univ-reims.fr, regis.huez@univ-reims.fr
Re´sume´ – La spectroscopie Raman est un outil puissant d’analyse de la composition mole´culaire d’e´chantillons biologiques.
La complexite´ de certains tissus rend l’analyse des spectres tributaire de me´thodes d’extraction des informations pertinentes.
L’Analyse en Composantes Inde´pendantes est montre´e comme un outil efficace de se´paration des spectres a` condition que des
pre´traitements adapte´s et de´veloppe´s dans ce papier soient applique´s afin de line´ariser le mode`le ge´ne´ratif des spectres de´forme´s
par l’instrumentation.
Abstract – Raman spectroscopy is a powerful tool to analyze the molecular composition of biological samples. Some tissues
are complex and require the use of numerical methods in order to extract useful information. Independent Component Analysis
is shown as an efficient Raman spectra separation tool with the proviso that preprocessing steps are applied to linearize the
generative model of Raman spectra distorted by the instrumentation. Such preprocessing steps are developed in this article.
1 Introduction
La spectroscopie Raman est une technique vibration-
nelle d’analyse mole´culaire base´e sur l’interaction ine´las-
tique entre un laser et la matie`re a` analyser. En chaque
point de mesure, l’instrumentation enregistre un spectre
Raman qui est un vecteur Ik = [. . . , Ik(ν¯), . . .] dont chaque
e´le´ment Ik(ν¯) repre´sente l’intensite´ de la lumie`re diffu-
se´e au nombre d’onde ν¯. L’intensite´ diffuse´e est propor-
tionnelle au nombre de mole´cules vibrant en ce nombre
d’onde. Une proprie´te´ inte´ressante de la spectroscopie Ra-
man est que chaque mole´cule posse`de un spectre Raman
unique qui repre´sente sa signature spectrale. L’analyse du
spectre d’un e´chantillon permet donc d’identifier les diffe´-
rentes mole´cules qui y sont pre´sentes. La simplicite´ d’uti-
lisation et la puissance d’analyse de cette me´thode en ont
fait son succe`s qui se traduit par de multiples applications
notamment dans le biome´dical [1].
Un spectre Raman est compose´ d’intensite´s positives ou
nulles et peut eˆtre vu comme une superposition de pics as-
similables a` des gaussiennes ou des lorentziennes. L’e´tude
d’e´chantillons biologiques complexes peut s’ave´rer difficile
a` cause des recouvrements de pics. En particulier, les si-
gnatures Raman de certaines espe`ces chimiques peuvent
cacher celles d’autres espe`ces d’inte´reˆt. Des exemples de
tels spectres Raman acquis sur une biopsie paraffine´e de
peau humaine, qui est le support d’e´tude de cet article,
sont propose´s sur la figure 1. La signature Raman intense
de la paraffine cache les informations vibrationnelles de la
peau et empeˆche le diagnostic de cancers de la peau.
Une me´thode efficace d’analyse a e´te´ propose´e dans [2].
La mode´lisation des spectres Raman acquis a` la surface
d’un e´chantillon biologique comme un me´lange line´aire et
instantane´ des signatures spectrales des espe`ces mole´cu-
laires pre´sentes dans cet e´chantillon et la forme ge´ne´rale
des spectres Raman (pics parcimonieux non superpose´s
des diffe´rentes espe`ces) y ont e´te´ montre´es suffisantes pour
l’application des me´thodes de se´paration de sources, en
particulier de l’Analyse en Composantes Inde´pendantes
(ACI) [3], sur ces types de signaux. Dans [4], les spectres
acquis a` la surface d’une petite coupe paraffine´e de peau
humaine (280×280 µm2) ont e´te´ prouve´s constitue´s de 3
sources de paraffine et d’une source de peau repre´sente´es
sur la figure 2. Des experts ont mis en e´vidence dans le
spectre estime´ de la peau plusieurs pics et bandes spec-
trales caracte´ristiques de ses divers constituants (ADN,
prote´ines, . . . ) [2], ce qui rend possible la discrimination
des me´lanomes et confirme l’efficacite´ de la me´thode.
Expe´rimentalement, aux signaux Raman purs s’ajoutent
des effets perturbateurs tels que le fond de fluorescence,
le de´calage en nombre d’onde des pics Raman et l’he´te´ro-
ge´ne´ite´ des largeurs de pics. Les spectres Raman bruts ne
respectent donc plus le mode`le line´aire et instantane´ de
l’ACI dont l’application aboutit a` l’estimation de sources
aberrantes comme le prouve la figure 3 qui montre l’ap-
plication de l’ACI sur les spectres Raman bruts acquis
sur une grande biopsie paraffine´e de peau humaine. Il est
e´vident que ces sources sont comple`tement diffe´rentes de
Colloque GRETSI, 11-14 septembre 2007, Troyes 145
celles pre´sente´es sur la figure 2.
Dans le pre´sent article, nous nous inte´ressons au de´ve-
loppement de pre´traitements adapte´s a` la correction des
effets perturbateurs pre´cite´s (afin de retrouver le mode`le
line´aire et instantane´ de l’ACI) et a` leurs effets sur les es-
timations de l’ACI applique´e sur des spectres Raman de
peau humaine paraffine´e.
2 Description des donne´es et du
mode`le
L’e´tude est faite sur 952 spectres Raman acquis sur une
grande coupe paraffine´e (10×10 mm2) de peau humaine
dans l’intervalle spectral allant de 657 a` 1821 cm−1, soit
990 e´chantillons par spectre. Le jeu de donne´es est donc
une matrice I = [. . . , ITk , . . .]
T ∈ RN×Nν¯ ou` .T est l’ope´ra-
teur de transposition, N = 952 est le nombre de spectres,
et Nν¯ = 990 est le nombre de nombres d’onde d’acquisi-
tion. La figure 1 repre´sente deux spectres (en traits pleins)
acquis en deux points diffe´rents de l’e´chantillon.
Le mode`le a e´te´ prouve´ line´aire et instantane´ (apre`s
l’application de pre´traitements adapte´s qui vont eˆtre de´-
crits dans la suite) [2], et constitue´ de 4 sources dans une
e´tude pre´liminaire sur des donne´es similaires [4] acquises
sur une petite coupe paraffine´e (280×280 µm2) : 3 sources
de paraffine et 1 source de peau repre´sente´es sur la figure
2. La parcimonie et la non-superposition des diffe´rents pics
de la paraffine me`nent a` l’annulation des cumulants croi-
se´s d’ordres supe´rieurs des 4 sources [2], prouvant leur in-
de´pendance. L’ACI peut alors eˆtre utilise´e pour extraire
ces sources. Nous avons utilise´ parmi les techniques d’ACI
l’algorithme JADE (Joint Approximate Diagonalization of
Eigenmatrices) [5] mais l’application d’autres algorithmes
tels que MD (Maximal Diagonality) [6] ou FastICA [3]
me`ne aux meˆmes re´sultats.
3 La ligne de base
Les e´chantillons biologiques sont connus pour e´mettre
de la fluorescence qui est un effet en compe´tition avec la
800 1000 1200 1400 1600 1800
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
Fig. 1 – Exemples de 2 spectres Raman (continus) et leurs
lignes de base associe´es (pointille´s) acquis en 2 points dif-
fe´rents d’une grande coupe paraffine´e de peau
diffusion Raman. Ce fond de fluorescence s’exprime sous
la forme d’une ligne de base diffe´rente d’un spectre ac-
quis a` un autre et est repre´sente´ en pointille´s sur la fi-
gure 1. Au point d’acquisition k, le fond de fluorescence
Fk se mode´lise par une fonction polynoˆmiale a
T
kΛ d’ordre
L dont les coefficients diffe`rent d’un point d’acquisition
a` un autre. Le vecteur ak = [. . . , aki , . . .]
T ∈ RL+1 de´fi-
nit le vecteur des coefficients du polynoˆme et la matrice
Λ = [. . . ,Λi, . . .] ∈ R
(L+1)×Nν¯ est la transpose´e de la ma-
trice de Vandermonde des nombres d’onde [7].
Dans cet article, la me´thode de Mazet [7], base´e sur
la minimisation d’une fonction couˆt quadratique tronque´e
Q(ak) =
∑Nν¯
i=1 φ(Ik(ν¯i)− a
T
kΛi) ou` φ(x) = x
2 si x < γ et
φ(x) = γ2 sinon, a e´te´ utilise´e puisqu’elle permet de s’af-
franchir des pics Raman de forte intensite´ et d’incorporer
le seuil γ lie´ a` la puissance du bruit. Une fois estime´e, cette
ligne de base Fk est soustraite au spectre brut Ik [8].
L’algorithme JADE [5] d’ACI a e´te´ applique´ sur les don-
ne´es brutes et sur les donne´es corrige´es de leur ligne de
base. Les sources estime´es dans ces deux cas sont respec-
tivement montre´es sur les figures 3 et 4. Une nette ame´-
lioration est visible puisque les composantes a` variation
lente (dues a` la ligne de base) visibles sur chaque source
estime´e de la figure 3 (en particulier la figure 3(d)) sont
absentes sur les sources de la figure 4 estime´es a` partir des
donne´es corrige´es de leur ligne de base.
4 Le de´calage des pics en nombre
d’onde
La re´solution spectrale de l’ordre de 4 cm−1 introduit
une incertitude sur la position exacte des maxima des pics
les plus intenses de la paraffine. Cette incertitude se mani-
feste par l’estimation de 2 sources (figures 4(b) et 4(a)) qui
ne diffe`rent que par les positions voisines de leurs pics prin-
cipaux ([1039.5, 1107.7, 1268.9] et [1043, 1111.2, 1272.5]
cm−1 respectivement).
Une proce´dure d’alignement des pics a e´te´ applique´e
aux spectres corrige´s de leur ligne de base afin d’e´limi-
ner cet effet [8]. Chaque pic de la paraffine est de´limite´
par son support en nombres d’onde. La proce´dure e´tant
identique pour tous les pics de la paraffine, nous nous li-
miterons a` l’expliquer dans le cas d’un pic de support D.
Un sous-spectre de re´fe´rence IRef (D) doit eˆtre choisi afin
d’aligner les autres sous-spectres sur son maximum. Ce
sous-spectre est celui qui a la distance euclidienne globale
avec tous les autres sous-spectres la plus petite. La pro-
ce´dure e´tant identique pour tous les sous-spectres, nous
allons donc nous limiter au recalage d’un seul sous-spectre
Ik(D). La fonction d’intercorre´lation CRef,k entre le sous-
spectre de re´fe´rence IRef (D) et le sous-spectre Ik(D) est
calcule´e. Le maximum de cette intercorre´lation se situe
au de´calage en nombre d’onde ne´cessaire pour aligner le
pic avec sa re´fe´rence. Afin d’obtenir des de´calages infe´-
rieurs a` un e´chantillon, ces sous-spectres pourront eˆtre
sur-e´chantillonne´s. Finalement Ik(D) est recale´ en utili-
sant la transforme´e de Fourier et se transforme en I˜k(D).
Le recalage peut introduire des discontinuite´s entre Ik(D)
et I˜k(D) sur les bords de D. Une ponde´ration de chaque
146
800 1000 1200 1400 1600
0
2
4
6
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10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(a) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(b) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600
−1
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2
3
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5
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7
8
9
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(c) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600
−0.4
−0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(d) Peau
Fig. 2 – Sources estime´es par ACI sur une petite coupe paraffine´e de peau dans [4]
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(a) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(b) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−1
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2
3
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5
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7
8
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Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(c) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
−1.5
−1
−0.5
0
0.5
1
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(d) Peau
Fig. 3 – Sources estime´es par JADE sur les donne´es brutes
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
10
12
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(a) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
10
12
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(b) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
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ité
(c) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−8
−6
−4
−2
0
2
4
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(d) Peau
Fig. 4 – Sources estime´es par JADE sur les donne´es corrige´es de leur ligne de base
800 1000 1200 1400 1600 1800
−1
0
1
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3
4
5
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7
8
9
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(a) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
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12
14
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(b) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
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4
6
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Nombre d’onde en cm−1
In
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(c) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−1
0
1
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3
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7
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(d) Peau
Fig. 5 – Sources estime´es par JADE sur les donne´es aligne´es en nombre d’onde
800 1000 1200 1400 1600 1800
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(a) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(b) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−2
0
2
4
6
8
10
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(c) Paraffine
800 1000 1200 1400 1600 1800
−1.5
−1
−0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
Nombre d’onde en cm−1
In
te
ns
ité
(d) Peau
Fig. 6 – Sources estime´es par JADE sur les donne´es uniformise´es en largeur de pics
Colloque GRETSI, 11-14 septembre 2007, Troyes 147
signal respectivement par une feneˆtre de Hanning Hh et
par son comple´mentaire a` 1 permet de s’affranchir de ces
effets : I¯k(D) = (˜Ik(D)×Hh) + (Ik(D)× (1−Hh)).
La figure 5 pre´sente les spectres estime´s par JADE sur
ces donne´es doublement corrige´es. L’estimation s’est en-
core une fois ame´liore´e avec 4 sources distinctes contrai-
rement a` la figure 4.
5 L’he´te´roge´ne´ite´ des largeurs des
pics
L’inclinaison, les imperfections de de´coupe et l’alte´ra-
tion de l’e´chantillon sont autant de facteurs qui peuvent
faire varier la largeur des pics Raman en des points d’ac-
quisition spatialement e´loigne´s. Ces variations biaisent les
estimations par ACI comme le montrent les figures 5(b) et
5(d) qui pre´sentent, au voisinage du nombre d’onde 1271.4
cm−1, respectivement un pic Raman et la forme d’une de´-
rive´e seconde d’un pic Raman. Cette dernie`re forme est
caracte´ristique de l’he´te´roge´ne´ite´ de la largeur du pic.
Une proce´dure d’uniformisation de la largeur des pics
Raman caracte´ristiques de la paraffine a e´te´ applique´e aux
spectres Raman corrige´s de leur ligne de base et de leur de´-
calage des pics en nombre d’onde. Comme pre´ce´demment,
la me´thode est pre´sente´e brie`vement pour un pic de pa-
raffine et un spectre acquis. E´tant plus simple d’agrandir
la largeur d’un pic que de la diminuer par la proce´dure
pre´sente´e, le sous-spectre de re´fe´rence I¯Ref (D) est cal-
cule´ comme la moyenne des 20% de sous-spectres de plus
grande largeur afin d’e´liminer divers pics aberrants . Puis
le noyau de convolution H = [h2, h1, 1, h1, h2] est estime´
par minimisation de la distance euclidienne entre I¯Ref (D)
et le sous-spectre transforme´ I˘k(D) = I¯k(D)∗H ou` ∗ sym-
bolise le produit de convolution. Finalement, comme dans
la section pre´ce´dente, les effets de bords sont traite´s graˆce
a` des feneˆtres de Hanning par : Iˆk(D) = (˘Ik(D) ×Hh) +
(¯Ik(D)× (1−Hh))
La figure 6 pre´sente les spectres estime´s par JADE sur
ces donne´es triplement corrige´es. Ces 4 sources sont spec-
troscopiquement interpre´tables. Les figures 6(a), 6(b) et
6(c) restituent les informations spectrales de la paraffine
[4], tandis que la figure 6(d) correspond pratiquement par-
faitement au spectre Raman de la peau [2].
6 Discussion
L’analyse successive des figures 3, 4, 5 et 6 montre l’ef-
ficacite´ des traitements applique´s aux spectres avant l’uti-
lisation de l’ACI. Alors que sur les figures 3, 4 et 5, les
sources estime´es ne repre´sentent aucune signature spec-
trale des entite´s pre´sentes dans l’e´chantillon, celles de la
figure 6 sont facilement identifiables aux sources de la fi-
gure 2 obtenues lors d’une e´tude pre´ce´dente [4] valide´e par
des experts en spectroscopie Raman.
Un autre sujet de discussion concerne la positivite´. Il
est vrai qu’une proprie´te´ des spectres Raman est leur po-
sitivite´. On pourrait donc s’attendre a` estimer des sources
positives. Cependant, les spectres sont centre´s et normali-
se´s a` une variance unite´ avant l’application de JADE. Les
sources estime´es seront donc force´ment centre´es.
Cependant, la matrice de me´lange estime´e par ACI (en
meˆme temps que la matrice des sources et qui de´finit les
profils de concentrations associe´s [2, 4, 8]) n’est compose´e
que d’e´le´ments positifs. Cette observation est en accord
avec la positivite´ des concentrations des espe`ces constitu-
tives de l’e´chantillon analyse´ auxquelles sont assimile´s les
coefficients de me´lange.
7 Conclusion
Une ACI peut s’ave´rer mal adapte´e lorsqu’elle est ap-
plique´e sur des spectres Raman bruts. Des de´formations
d’origine mate´rielle cassent le mode`le line´aire et instan-
tane´ de l’ACI. Afin de line´ariser le mode`le ge´ne´ratif des
spectres Raman, des pre´traitements efficaces et adapte´s a`
la ligne de base, au de´calage en nombre d’onde des pics Ra-
man intenses et a` la de´formation de la largeur de ces pics
ont e´te´ propose´s. Leur application sur des spectres Raman
acquis a` la surface d’un e´chantillon paraffine´ de peau hu-
maine a e´te´ prouve´e comme pre´alablement indispensable
a` l’application de l’ACI afin d’estimer efficacement des in-
formations cache´es par la signature Raman intense de la
paraffine.
Re´fe´rences
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mars 2006.
148


De l'importance des traitements préalables à l'application de l'Analyse en Composantes Indépendantes en spectroscopie Raman

http://documents.irevues.inist.fr/bitstream/2042/17463/1/GRETSI_2007_145.pdf

De l'importance des traitements préalables à l'application de l'Analyse en Composantes Indépendantes en spectroscopie Raman

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