ANJOS, M. R. dos

CASTRO, I. M. de

Portuguese

Infoteca-e

58ISSN 0103-5231Dezembro, 2009Rio de Janeiro, RJDeterminação de Aflatoxinasem Milho por CromatografiaLíquida de Alta Eficiência comDetecção por Fluorescência -CLAE/DFIzabela Miranda de Castro1Marianna Ramos dos Anjos21 Química, Ph.D. em Química Orgânica, pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,imcastro@ctaa.embrapa.br2 Química, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ, marianna@ctaa.embrapa.br1IntroduçãoO milho é um cereal relevante tanto para alimentaçãoanimal quanto humana. A importância sócio-econômicado milho como ingrediente essencial da dietaevidencia-se pela participação em mais de 500produtos alimentícios. O milho sobressai em relação aoutros cereais pela sua maior diversidade deaplicações, que vai desde planta forrageira/ração aalimento humano. Adicionalmente, a distribuiçãoglobal, baixo custo, elevado número de cultivares e assuas propriedades biológicas e industriais geramcentenas de derivados. Cerca de 70% da produçãomundial se destina à alimentação humana e animal. Domilho produzido no Brasil, entre 70% a 80% sedestina às indústrias de ração, enquanto que oconsumo humano absorve apenas 1,6% do totalproduzido. Enfim, o consumo industrial, excetuando osetor de rações animais, mantém um consumo anualmédio ao redor de 4,5 milhões de toneladas (BRUM;LUFT, 2008).O Brasil foi, em 2007, o terceiro produtor mundial demilho, com um total de cerca de 51 milhões detoneladas, seguindo os Estados Unidos e a China(IBGE, 2008). Devido às condições climáticas e aoatual cenário econômico favorável, a cultura do milhoestá em expansão nas principais regiões produtoras,sul, sudeste e centro-oeste do Brasil. No entanto, omilho é um dos cultivos mais predispostos àcontaminação por fungos produtores de micotoxinas,que pode ocorrer no campo, antes e após a colheita, etambém durante o transporte e armazenamento doproduto. As micotoxinas são metabólitos fúngicossecundários altamente tóxicos e carcinogênicos, queprovocam grandes perdas econômicas na cadeiaprodutiva agrícola, representando, atualmente, riscopotencial para o agronegócio brasileiro e para a saúdehumana e animal. A crescente preocupação com ainocuidade e a qualidade dos produtos agrícolas temlevado os países importadores a serem mais exigentesquanto à segurança dos alimentos. A presença dessescontaminantes representa, atualmente, um dosprincipais entraves técnicos à comercialização dosprodutos agrícolas no mercado internacional.As aflatoxinas foram descobertas há mais de 30 anose têm sido tema de muitas pesquisas. Em condições2 Determinação de Aflatoxinas em Milho por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Fluorescência - CLAE/DFhemiacetais pela mistura derivatizante - água: ácidotrifluoracético: ácido acético 7:2:1 (v/v) comaquecimento a 65ºC por 8,5min. A seguir esta soluçãofoi analisada no sistema CLAE/DF.Quantificação usando o sistema CLAE/DFCURVA PADRÃOPartindo de uma solução padrão certificada contendoas quatro aflatoxinas, foram preparadas cincosoluções com concentrações diferentes das AFs paraos sete pontos da curva. Uma alíquota de 0,3mL dacada solução foi transferida para os frascos dederivatização onde foram acrescentados 0,6mL doagente derivatizante, sendo aquecido a 65ºC por8,5min. As concentrações nas curvas de calibraçãopara B1 e G1 variam na faixa de 0,0004 a 0,0203µg/mL, enquanto que para B2 e G2 situam-se de 0,0002a 0,0103 µg/mL.SISTEMA CLAE/DFUtilizou-se um sistema cromatográfico Waters,composto de amostrador automático WAT717, bombaquaternária WAT600, degasser, forno de colunas a40°C e detector de fluorescência WAT2475.PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSColuna cromatográfica - X Terra® RP 18, (4,6 x150mm; 5µm);Fase móvel - fase ternária composta por acetonitrila,metanol e água ultra-pura com fluxo de 1,2mL/min emmodo gradiente de acordo com o quadro abaixo:Detector de fluorescência: ë ex- 360nm e ë em-440nm;Volume de injeção - 10µL.ENSAIOS DE RECUPERAÇÃOForam conduzidos ensaios de recuperação em trêsníveis de contaminação com sete replicatas em cadanível. Nestas análises foram usados os procedimentosdescritos para o modo de preparo e extração seguidosda quantificação pelo sistema CLAE-DF. Os níveis decontaminação aplicados estão descritos a seguir:1) nível 1: para as aflatoxinas B1 e G1 - 2,0µg/kg eTempo (min) % Acetonitrila % Metanol % Água 0 10 10 80 3 25 15 60 8 25 15 60 8,1 10 10 80  apropriadas, Aspergillus flavus ou A. parasiticuspodem se desenvolver no milho, amendoim, castanha-do-brasil e muitos outros produtos de base, podendoproduzir as micotoxinas. Essas são metabólitos deelevado potencial carcinogênico, mutagênico eteratogênico, que interferem no funcionamento dosistema de imunidade. Elas ocorrem e exercem seusefeitos tóxicos em quantidades extremamentepequenas nos alimentos. Por isso, a identificação eavaliação quantitativa geralmente requeremamostragem específica, além de métodos de extraçãoe detecção sensíveis e eficientes.O método aqui proposto, implantado para a matrizmilho, envolve a extração das aflatoxinas (AFs) – B1,G1, B2 e G2 - com solvente orgânico seguida depurificação através de colunas de purificaçãoMycosep® e derivatização com ácido trifluoroacético(WILSON; ROMER, 1991). A quantificação é feita porpadronização externa em sistema de cromatografialíquida de alta eficiência com detector de fluorescência- CLAE/DF.Metodologia DesenvolvidaAnálise das aflatoxinasPREPARO DA AMOSTRAAs amostras foram trituradas em processador dealimentos até homogeneização completa do produto.EXTRAÇÃOForam pesadas cerca de 25g da amostra emrecipiente de vidraria própria do homogeneizador/dispersor de alta rotação Omni Mixer®, onde seadicionou 100mL da mistura acetonitrila (grau HPLC):água 84:16 (v/v). A mistura foi agitada por 3 minutosa 800rpm e depois filtrada em papel quantitativo defiltração rápida.PURIFICAÇÃOForam transferidos 8mL do filtrado para o tubo devidro próprio da coluna Mycosep®. A coluna foiintroduzida no tubo com a solução. Foram retirados4mL do eluato e evaporados à secura, sob atmosferade nitrogênio, em banho-maria a 40ºC. A seguir,ressuspendeu-se com 0,6mL de acetonitrila etransferiu-se para frasco onde foram adicionados1,2mL do agente derivatizante.DERIVATIZAÇÃO DAS AFLATOXINASAs aflatoxinas foram convertidas em seus3Determinação de Aflatoxinas em Milho por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Fluorescência - CLAE/DFpara B2 e G2 - 1,0µg/kg;2) nível 2: para as aflatoxinas B1 e G1 - 4,0µg/kg epara B2 e G2 - 2,0µg/kg;3) nível 3: para as aflatoxinas B1 e G1 - 8,0µg/kg epara B2 e G2 - 4,0µg/kg;Em cada análise, a concentração encontrada paracada aflatoxina é comparada à quantidade teóricaadicionada em cada nível de fortificação para efeito docálculo da percentagem de recuperação.Avaliação do método de análise propostoO cromatograma obtido para a análise da soluçãopadrão das quatro aflatoxinas está mostrado na Fig. 1.Pode-se observar que os quatro analitos apresentamuma ótima resolução cromatográfica com ascondições cromatográficas aplicadas.Fig.1: Cromatograma da solução padrão de aflatoxinasusando as condições descritas para o sistema CLAE-DFA validação de um procedimento analítico tem comoobjetivo a comprovação de que o método a serutilizado é apropriado à finalidade para o qual foidesenvolvido. Os parâmetros considerados nestetrabalho incluem a linearidade (coeficiente decorrelação), a taxa de recuperação e os limites dequantificação e de detecção.A linearidade do método, avaliada para umadeterminada faixa de trabalho, corresponde aointervalo de concentrações do analito usadas nacomposição da curva de calibração e deve,obrigatoriamente, apresentar coeficiente de correlação(R²) adequado. A construção das quatro curvasanalíticas para as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 pormeio do método de ajuste pelos mínimos quadrados,permite a quantificação de cada aflatoxina e deve,obrigatoriamente, apresentar linearidade. As curvasobtidas, com seus respectivos coeficientes decorrelação (R²), encontram-se na Fig. 2.  Fig. 2: Curvas de calibração das aflatoxinas B1, B2,G1 e G2 obtidas no sistema CLAE-DFOs valores obtidos para R2 para as quatro aflatoxinas(0,998) demonstram a linearidade das curvas obtidas.Assim, a faixa de trabalho do método, quecorresponde ao intervalo de concentrações de cadaanalito usado na composição da curva de calibração, élinear e pode ser usada para quantificação.Outro parâmetro importante na validação de ummétodo é a percentagem de recuperação. Este valorcorresponde à razão entre a quantidade do analitoadicionada à amostra e quantificada pelo métodoanalítico e a quantidade teórica adicionada à matrizantes do procedimento. As médias das recuperaçõesobtidas das sete replicatas para as quatro aflatoxinasanalisadas pelo presente método encontram-se naTabela 1.Os valores encontrados estão dentro do valorrecomendado pelo regulamento (CE) nº 401/2006 daUnião Européia (COMISSÃO DAS COMUNIDADESEUROPÉIAS, 2006): 70 a 110%, para concentraçõesentre 1 a 10µg/kg.Tabela 1: Taxas de recuperação das aflatoxinas emmilho para três níveis de contaminação.*os valores apresentados representam a média desete replicatasNeste estudo os limites de detecção (LD) equantificação (LQ) foram calculados utilizando dadosde regressão da curva de calibração calculada pelaferramenta Regressão disponível no software Excel(MS Office).O erro padrão da curva foi calculado e este valorAflatoxina  Nível 1 *  Nível 2*  Nível 3 *  B1 84%  98% 96% B2 99%  80% 109 % G1  91%  98% 105 % G2  100%  83% 77%  4 Determinação de Aflatoxinas em Milho por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detecção por Fluorescência - CLAE/DFExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 3622-9600Fax: (0XX21) 2410-1090 / 2410-9713Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2009): tiragem (50 exemplares)Presidente:  Virgínia Martins da MattaMembros:   Marcos José de Oliveira Fonseca, MaríliaPenteado Stephan, Renata Torrezan, Ronoel Luiz deO. Godoy, Nilvanete Reis Lima e André Luis doNascimento GomesSecretária:  Michele Belas CoutinhoSupervisor editorial: Comitê de PublicaçõesRevisão de texto: Virgínia Martins da MattaNormatização bibliográfica: Luciana S. de AraújoEditoração eletrônica:  Riane Rodrigues Tovar,Marcos Moulin, André Luis do Nascimento GomesComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 158Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 8234usado para o cálculo dos limites de detecção (LD) e dequantificação (LQ), sendo LD=3s/b e LQ=10s/b, ondes é o desvio (erro padrão) e b é o coeficiente angularda reta. Os valores calculados destes limites estão naTabela 2.Tabela 2: Valores de LD e de LQ das aflatoxinas B1,B2, G1 e G2 para o método em estudoO método proposto para análise de aflatoxinasempregando extração com acetonitrila e posterioranálise por CLAE-DF demonstrou ser adequado para amatriz milho, além de ser de execução relativamentesimples. O uso de um detector seletivo e sensívelcomo o detector de fluorescência e a aplicação de umgradiente de força da fase móvel permitiu a obtençãode cromatogramas onde a presença de interferentesnão prejudicou a quantificação dos analitos nasamostras. Observou-se comportamento linear para asquatro curvas na faixa de trabalho do método e oslimites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)obtidos são apropriados e possibilitam a quantificaçãodessas micotoxinas em baixas concentrações.ReferênciasBRUM, A. L.; LUFT, A. Aspectos da cadeia produtivado milho e as relações comerciais nos estados do RioGrande do Sul e Mato Grosso (1994/95-2005/06).Revista Extensão Rural, v. 15, n. 16, p. 117-143, jul./dez. 2008.COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPÉIAS.Regulamento (CE) nº 401/2006 da Comissão, de 23 defevereiro de 2006. Estabelece os métodos deamostragem e de análise para o controlo oficial dosAflatoxina  LD  (µg/kg)  LQ  (µg/kg)  B1  0,04 0,13  B2  0,02 0,08 G1  0,03 0,10 G2  0,03 0,11 teores de micotoxinas nos géneros alimentícios. JornalOficial da União Europeia, 9 mar. 2006. L 70, p. 12-34.IBGE. Tabela 1612: quantidade produzida, valor deprodução, área plantada e área colhida da lavouratemporária. Disponível em: <http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp?z=t&o=10&i=P>. Acesso em: 29 out.2008.WILSON, T. J.; ROMER, T. R. Use of the Mycosepmultifunctional cleanup column for liquidchromatographic determination of aflatoxins inagricultural products. Journal of Association ofOfficial Analytical Chemists, v. 74, n. 6, p. 951-956,nov./dec. 1991.

Determinação de aflatoxinas em milho por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência - CLAE/DF.

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Determinação de aflatoxinas em milho por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência - CLAE/DF.

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