MATOS, A.

OLIVEIRA, E. M. M.

PENTEADO, A. L.

TORREZAN, R.

Portuguese

Infoteca-e

patógenosextrato hidrossolúvel sojaDesenvolvimento de Metodologia para DetecçãoSimultânea de Organismo Geneticamente Modificado ede Patógenos em Extrato Hidrossolúvel de SojaPublicado o: 21/11/2012Autor/s. : Andrea Matos; Edna Maria Morais Oliveira; Renata Torrezan; Ana Lúcia PenteadoIntroduçãoA busca por métodos analíticos rápidos e multi-alvos é uma constante dentre os profissionais envolvidos nodesenvolvimento de metodologias analíticas. Dentro deste contexto, as equipes do Laboratório de DiagnósticoMolecular e de Microbiologia da Embrapa Agroindústria de Alimentos realizaram uma série de experimentoscom o objetivo de detectar simultaneamente a soja geneticamente modificada (soja RR) e bactérias patógenas,que possam estar presentes em extrato hidrossolúvel de soja. Material e MétodosPreparação do leite de sojaO extrato hidrossolúvel de soja foi produzido, segundo o proposto por Felberg et al. (2003), utilizando-se sojaconvencional e soja RR. Os teores de soja RR nas formulações foram de: 0,1% , 1,0% , 2,0% , 5,0%, 10,0% ,25,0% e 50,0%.Inoculaçãode Enterobacter spp. para garantir a contaminação nas formulações de sojaA contaminação das formulações com bactérias foi conduzida no Laboratório de Microbiologia, adicionando-se100mL  de  suspensão  de  células  de  Salmonella  enterititis  (mantidas  em  TSA),  com  60  UFC  (unidadesformadoras de colônia) por 1000mL de cada formulação.Extração de DNAO DNA total das formulações foi isolado usando o kit DNeasy (Qiagen) e o método descrito por Leão et al.(2004), com adaptações realizadas pela equipe do Laboratório de Dignóstico Molecular.Detecção/Quantificação de patógenos e de soja RRA  detecção  de  bactérias  foi  conduzida  por  reação  em  cadeia  da  polimerase  qualitativa  (PCR)  usandooligonucleotídeos iniciadores (primers) da região conservada do RNA ribossomal  de procariotos (16SrRNA),validados por Löfström (2004), no termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems). As condições para umvolume final de 50 mL de reação foram: 150ng de DNA total; dNTPs 0,4mM; MgCl2 3,5mM; 10nM mistura deprimers; 2,5U de enzima (Taq DNA polimerase). A ciclagem da reação foi conduzida a 95°C por 10 min; seguidode 40 ciclos composto das seguintes etapas: 95°C por 1 m inuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto;72°C por 4 minutos. Subsequentemente, os produtos da PCR foram analisados e fotodocumentados (SistemaVilbert-Biosystems).A soja RR foi detectata e quantificada por PCR em tempo real, usando o kit comercial GMO 35S Detection(Applied Biosystems), que usa o sistema TaqMan para a quantificação do fragmento do promotor 35S do vírusdo mosaico da couve-flor, componente da construção gênica presente na soja RR, além do fragmento do genepara lectina (gene endógeno da soja). As corridas de PCR em tempo real foram conduzidas no ABI SDS7000(Applied Biosystems).Também foram conduzidas reações usando Sistema SYBR GREEN, usando os primers já validados para lectina(GERMINI et al., 2004) e para RR (MARCELINO; GUIMARÃES; BARROS, 2007). A curva padrão foi construídausando material  de referência certificado (MRC),  contendo 0,0%; 0,5%; 1,0% e 2,0% de soja RR (padrõesFluka). Resultados e DiscussãoApós  a  PCR,  os  resultados  da  detecção  de  patógenos  presentes  nas  formulações  foram  analisados  poreletroforese horizontal. Na Fig 1. estão apresentados os produtos da PCR. Pode-se afirmar que os métodos deextração usados foram eficientes no isolamento de DNA total e que o patógeno foi  detectado em todos osisolados. Entretanto, os produtos da PCR foram mais específicos nas reações onde os extratos do kit DNeasyforam usados na reação (raias 3 e 4), quando comparados com os isolados obtidos com o método Leão et al.(2004) (raias 1 e 2) modificado pelo autor (dados não mostrados).1. Leite de soja convencional– extraído com Protocolo Leão et al. (2004) modificado pelo autor; 2. Leite de sojatransgênico – extraído com Protocolo Leão et al. (2004) modificado pelo autor; 3. Leite de soja convencional–extraído com Protocolo com kit comercial – DNeasy para bactérias; 4. Leite de soja transgênico– extraído comProtocolo com kit comercial – DNeasy para bactérias; 5. Controle positivo; 6. Padrão de 25 pb (Invitrogen)Figura 1: Produtos da PCR qualitativa para detecção de patógenos em formulações de soja.Micotoxinas  /  Artigos técnicos  /  Generalidades(58) (1) (0) (0)MicotoxinasVideos (14)Vertu DON-V , teste de micotoxinas paraalimentos. (Vicam)De: Vicam - BrasilPublicações (68)Metodologia para tratamento declorofórmio comercial para uso emseparações cromatográficasIntrodução O clorofórmio outriclorometano (CCl 3 ; M. ... O Risco das MicotoxinasAs micotoxinas são produtos normais dometabolismo de determinados tipos...Fóruns (39)Adsorventes de micotoxinasregistrados no BrasilLua F H, Favor entrar em contato maioresesclarecimentos - Olá voces t... Análises para filosilicatoscontinuação... 4 – Esta afirmação nãopode ser feita nenhum produto. isso osServiços ProfissionaisLuiz Celso Hygino DaCruzRio de Janeiro, Rio deJaneiro, BrasilGustavo Campos DeSouzaPonte Nova, Minas Gerais,BrasilJuliana TomelinBlumenau, Santa Catarina,BrasilMateus Silveira LopesPasso Fundo, Rio Grande doSul, BrasilVá para o Guia de ProfissionaisProdutosNEOVIAAmlan InternationalVicam - Brasil  T5XCALIBRIN ZMicotoxinas Entrar o registar-meHome Fóruns Artigos técnicos Guia de Profissionais Notícias Eventos Empresas e produtos Índice temático Vídeos Fotospatógenosextrato hidrossolúvel soja - Engormix http://pt.engormix.com/MA-micotoxinas/artigos/desenvolvimento-me...1 de 5 21/05/2013 13:46Com o objetivo de quantificar o percentual de soja RR no "leite de soja", foram conduzidas PCR em tempo real(quantitativas), usando a curva padrão construída com os dados obtidos dos padrões de soja RR (MRC). Aquantificação  de  OGM em alimentos  processados  é  importante,  pois  vai  ao  encontro  do  Decreto  Lei  deRotulagem (BRASIL, 2003).As curvas de amplificação da PCR em tempo real, a curva de dissociação e a curva padrão construída usandomaterial de referência certificado, contendo diferentes percentuais de soja RR, estão apresentadas na Fig. 2.Figura 2: A- Curvas de amplificação dos padrões de soja RR e das formulações, usando sistema TaqMan; B-Curvas de dissociação das reações que foram conduzidas usando o sistema SYBR GREEN; C- Curva padrãoconstruída a partir dos MRC de soja RR.Vicam - BrasilVicam - BrasilVer mais produtosAflaOchra HPLCDON-VMicotoxinas Entrar o registar-meHome Fóruns Artigos técnicos Guia de Profissionais Notícias Eventos Empresas e produtos Índice temático Vídeos Fotospatógenosextrato hidrossolúvel soja - Engormix http://pt.engormix.com/MA-micotoxinas/artigos/desenvolvimento-me...2 de 5 21/05/2013 13:46Na Tabela 1 estão apresentados os valores calculados para o percentual de OGM (soja RR) nas formulçõespreparadas no Laboratório de Leguminosoas.Tabela 1. Percentual de soja RR determinado a partir da curva padrão construída com os Materiais deReferência Certificados (MRC).Micotoxinas Entrar o registar-meHome Fóruns Artigos técnicos Guia de Profissionais Notícias Eventos Empresas e produtos Índice temático Vídeos Fotospatógenosextrato hidrossolúvel soja - Engormix http://pt.engormix.com/MA-micotoxinas/artigos/desenvolvimento-me...3 de 5 21/05/2013 13:46*Os pontos da curva padrão são de 0,0 a 5,0% de soja RR. ConclusãoCom apenas uma extração foi possível verificar a presença de DNA recombinante de Soja Round up Ready®,pela técnica PCR em tempo real (com sonda da Applied Biosystem e com SYBR GREEN - primers: Lectina(GERMINI et al., 2004); RR (MARCELINO; GUIMARÃES; BARROS, 2007) e DNA de bactérias pela técnica dePCR convencional.Embora a extração do DNA total tenha permitido a detecção dos dois alvos, é necessário o aperfeiçoamento dametodologia para conduzir uma única reação e detectar os dois alvos: bactéria e OGM. ReferênciasBRASIL. Decreto nº 4.680, de 24 de abril de 2003. Regulamenta o direito à informação, assegurado pela Lei no8.078, de 11 de setembro de 1990, quanto aos alimentos e ingredientes alimentares destinados ao consumohumano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de organismos geneticamente modificados, semprejuízo  do cumprimento  das demais  normas aplicáveis.  Diário Oficial  [da]  República  Federativa  do Brasil,Brasília,  DF,  25  abr.  2003.  Disponível  em:  <http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/  decreto/2003/d4680.htm>.Acesso em: 11 nov. 2009.FELBERG, I; CABRAL, L. C.; DELIZA, R.; FURTADO, A.; TORREZAN, R. Obtenção de bebidas esterilizadas àbase de soja e castanha-do-brasil. Rio de Janeiro: Embrapa Agroindústria de Alimentos, 2003. 2 p. (EmbrapaAgroindústria de Alimentos. Comunicado técnico, 65).GERMINI  A.  ;  MEZZELANI,  A.;  LESIGNOLI,  F.;  CORRADINI,  R.;  MARCHELLI,  R.;  BORDONI,  R.;CONSOLANDI,  C.  ;  DE BELLIS,  G.  Detection  of  genetically  modified  soybean using peptide nucleic  acids(PNAs) and microarray technology. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 52, n. 14, p. 4535-4540, 2004.LEÃO, S. C.; MARTIN, A.; MEJIA, G. I.; PALOMINO, J. C.; ROBLEDO, J.; TELLES, M. A. da S.; PORTAELS, F.Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria. 2004. 164 p. Disponível em:<http://www.esmycobacteriology.eu/ Inco.htm>. Acesso em: 10 out. 2009.LÖFSTRÖM,  C.;  KNUTSSON,  R.;  AXELSSON,  C.  E.;  RÅDSTRÖM,  P.  Rapid  and  specific  detection  ofSalmonella  spp.  in  animal  feed  samples  by  PCR  after  culture  enrichment.  Applied  and  EnvironmentalMicrobiology, v. 70, n. 1, p. 69-75, jan. 2004.MARCELINO,  F.  C.;  GUIMARÃES,  M.  F.  M.;  BARROS,  E.  G.  de.  Detecção  e  quantificação de  alimentosgeneticamente modificados: o panorama brasileiro. Revista Ceres, Viçosa, MG, v. 54, n. 313, p. 239- 249, 2007. Autor/s.Re: Desenvolvimento de Metodologia para Detecção Simultânea de Organismo Geneticamente Modificado e dePatógenos em Extrato Hidrossolúvel de Soja06/12/2012 | como realiza o processo de quantificação? é um programa que já passa aporcentagem de OGMs ?Deseja opinar nesta discussão sobre: ?Engormix.com se reserva o direito de apagar e/ou modificar os comentários. Veja mais detalhes Andrea Matos, BrasilQuímica, analista da Embrapa Agroindústria d… Edna Maria Morais Oliveira, BrasilEng. Quím., D.Sc., Pesquisadora da Embrapa …(58) (1) (0) (0)Aline Gomes De SouzaUberlândia, Minas Gerais, Brasilduvida sobre o artigo(0) (0)Micotoxinas Entrar o registar-meHome Fóruns Artigos técnicos Guia de Profissionais Notícias Eventos Empresas e produtos Índice temático Vídeos Fotospatógenosextrato hidrossolúvel soja - Engormix http://pt.engormix.com/MA-micotoxinas/artigos/desenvolvimento-me...4 de 5 21/05/2013 13:46COMENTAR    |     Quem somos nós?     |     Fale conosco Copyright © 1999-2013 Engormix.com - All Rights ReservedMicotoxinas Entrar o registar-meHome Fóruns Artigos técnicos Guia de Profissionais Notícias Eventos Empresas e produtos Índice temático Vídeos Fotospatógenosextrato hidrossolúvel soja - Engormix http://pt.engormix.com/MA-micotoxinas/artigos/desenvolvimento-me...5 de 5 21/05/2013 13:46

Desenvolvimento de metodologia para detecção simultânea de organismo geneticamente modificado e de patógenos em extrato hidrossolúvel de soja.

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Desenvolvimento de metodologia para detecção simultânea de organismo geneticamente modificado e de patógenos em extrato hidrossolúvel de soja.

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