DAMASCENO, C. M. B.

PARRELLA, R. A. da C.

RODRIGUES, J. A. S.

SCHAFFERT, R. E.

Infoteca-e

Sete Lagoas, MG Dezembro, 2012184ISSN 1679-1150AutoresCynthia M.B. DamascenoBióloga, Ph.D. em Biologia Molecular, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, cynthia.damasceno@embrapa.brRafael A. da Costa ParrellaEng.-Agr., D.Sc. em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, rafael.parrella@embrapa.brJosé Avelino S. RodriguesEng.-Agr., D.Sc. em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, avelino.rodrigues@embrapa.brRobert Eugene SchaffertEng.-Agr., Ph.D. em Genética e Melhoramento de Plantas, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, robert.schaffert@embrapa.brValidação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido Etanol de Segunda Geração A produção do etanol de segunda geração consiste na utilização da biomassa, de origem lignocelulósica, no caso de fontes vegetais, para a conversão biológica da celulose e da hemicelulose em açúcares fermentáveis. Uma das etapas mais caras nesse processo é o pré-tratamento, que pode ser químico, físico ou enzimático, e cuja função é reduzir a interação entre os carboidratos da parede celular e a lignina, um composto polifenólico heterogêneo, que afeta negativamente os processos subsequentes de sacarificação e fermentação (SIMS et al., 2010). Assim, a seleção ou engenharia de culturas vegetais para esse fim deve contemplar alterações na parede celular de maneira que a celulose fique mais acessível às enzimas hidrolíticas, seja por redução dos teores de lignina e/ou menor cristalinidade da fibra de celulose (NAIK et al., 2010; JORDAN et al., 2012). Na tentativa de solucionar esse problema, várias linhas de pesquisa têm focado na identificação, caracterização e manipulação de genes relacionados às vias biossintéticas dos principais polímeros da parede celular, em especial da lignina, para a obtenção de materiais vegetais com características mais adequadas para produção de etanol de segunda geração (SIMMONS; LOQUÉ; RALPH, 2010; DAUWE et al., 2007; CHEN; DIXON, 2007). Além de várias fábricas piloto instaladas no Brasil, a partir do final de 2013 será construída a primeira planta industrial de biocombustível celulósico do país, no Estado de Alagoas (AL). Apesar dos altos custos de produção de enzimas hidrolíticas, necessárias para o processo de produção de etanol de segunda geração, acredita-se que com a tecnologia atual e utilizando-se biomassa de alta qualidade, a produção de etanol a partir de biomassa disponível, como o bagaço de cana, torna o processo bastante competitivo. Além disso, estima-se que a usina será capaz de produzir 82 milhões de litros de etanol por ano, demonstrando o grande potencial de mercado desta tecnologia (ÚNICA, 2012). O sorgo de alta biomassa tem grande potencial para ser uma cultura destinada à produção de etanol de segunda geração. Além de possuir acessos genéticos com alta produtividade que em média podem chegar a mais de 30 ton/ha de matéria seca, o sorgo é uma cultura com tolerância a vários tipos de estresses bióticos e abióticos, além de ser mecanizável e propagar-se por semente. Alguns materiais experimentais do programa de melhoramento de sorgo da Embrapa já apresentam produtividade acima de 50 ton/ha de matéria seca. Uma característica importante é que o sorgo 2 Validação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido já apresenta naturalmente menores teores de lignina que a cana-de-açúcar, além de possuir mutantes de lignina que podem apresentar até 50% menos lignina que a cultivar original. A Característica Nervura Marrom (brown midrib)Mutantes para genes da síntese de lignina já foram descritos em milho e sorgo, e denominados brown midrib por causa da formação de tecido vascular marrom-avermelhado nas folhas e nos colmos, fenótipo que está ligado a modificações da lignificação dos tecidos (SATTLER; FUNNELL-HARRIS; PEDERSEN, 2010). Por causa disso, esses mutantes tornaram-se modelos para estudos genéticos e bioquímicos do processo de lignificação em milho, sorgo e outras gramíneas. Enquanto quatro mutantes brown midrib em milho (bm) se originaram de mutações recessivas espontâneas, os mutantes brown midrib de sorgo (bmr) foram gerados por mutagênese química em sementes tratadas com dietil sulfato (PORTER et al., 1978). Estudos de alelismo feito por Saballos et al. (2008) com os mutantes bmr demonstraram a existência de quatro locos em sorgo, correspondendo às mutações bmr2, bmr6, bmr12 e bmr19. Vários mutantes bmr em sorgo têm um conteúdo de lignina significantemente menor em colmos e folhas quando comparados às linhagens das quais se originaram, podendo chegar a uma redução de 50%, dependendo do background genético. A Embrapa Milho e Sorgo recentemente lançou um híbrido de sorgo de pastejo, BRS 810, o qual apresenta a característica nervura marrom. Por causa do menor conteúdo de lignina, o híbrido BRS 810 apresenta melhor digestibilidade e conversão alimentar, possibilitando maior produção de carne e leite (RIBAS, 2010; FERREIRA et al., 2012).Baseado nos dados de aumento de digestibilidade em mutantes bmr, foi postulado que a característica brown midrib poderia aumentar a sacarificação enzimática. Esse foi o caso para alguns dos mutantes, em especial bmr12, que gerou mais glicose e xilose após a sacarificação enzimática do que o genótipo controle (VERMERRIS et al., 2007). Outros mutantes bmr (bmr6 e bmr12) têm sido estudados quanto a sua eficiência na conversão de biomassa, concluindo-se que há maior liberação de açúcares fermentáveis após sacarificação enzimática da biomassa de sorgo em linhagens mutantes bmr quando comparadas com as não mutantes correspondentes (SABALLOS et al., 2008; DIEN et al., 2009). Assim, a redução do conteúdo de lignina pode apresentar um impacto positivo na eficiência de conversão da biomassa de sorgo bmr em açúcares simples, o que tornaria o processo de produção de etanol de segunda geração mais eficiente e economicamente mais competitivo. Validação de Marcadores Moleculares Tipo CAPS Ligados ao Gene bmr6 para Utilização em Retrocruzamento AssistidoA fim de auxiliar no desenvolvimento de híbridos de sorgo biomassa com menor teor de lignina e, portanto, com grande potencial para produção de etanol de segunda geração, um protocolo utilizando marcadores tipo CAPS (Cleaved-Amplified Polymorphic Sequence), desenvolvido para o gene bmr6, foi validado. Esse protocolo consiste na utilização de marcadores moleculares específicos para o gene bmr6, a fim de se empregar seleção assistida para a característica nervura-marrom. Resumidamente, após a extração do DNA a partir da folha do indivíduo a ser analisado, é feita uma reação de PCR com os primers específicos para o gene bmr6. Os produtos de amplificação são então clivados com uma enzima de restrição específica para o sítio de mutação bmr6. Os fragmentos de DNA amplificados e clivados são posteriormente separados por eletroforese em gel de agarose 3Validação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido e visualizados para identificação do genótipo analisado, que pode ser: Bmr6/Bmr6; Bmr6/bmr6; bmr6/bmr6.Três progênies RC1F1 foram desenvolvidas cruzando-se três linhagens R elite de sorgo (alta biomassa) com a linhagem contendo o alelo bmr6. O marcador CAPS bmr6 foi utilizado para selecionar genótipos heterozigotos nas populações de retrocruzamento 1 (RC1F1) dos referidos cruzamentos. A característica nervura-marrom é recessiva e, por isso, o uso de marcadores moleculares codominantes para identificação de heterozigotos nos ciclos iniciais de retrocruzamentos é bastante útil, não sendo necessária uma geração extra de autofecundação para identificação dos genótipos que contêm o alelo bmr6.O marcador tipo CAPS utilizado foi desenvolvido por Sattler et al. (2009) para verificar a mutação pontual do gene mutante bmr6, o qual corresponde ao gene SbCAD2, localizado no cromossomo 4. Esse gene codifica para a enzima cinamil álcool desidrogenase (CAD) da via de síntese da lignina (SABALLOS et al., 2009; SATTLER et al., 2009) (Figura 1).Primers específicos foram desenhados por Sattler et al. (2009) para amplificar um fragmento de 613 pb dos alelos Bmr6/bmr6 (bmr6 CAPS-F CACAACCACTCCACTACTGCGAAC, bmr6 CAPS-R: GTCACCACAAGGCATCCATACG). A transição C-T que corresponde à mutação bmr6  gerou um sítio de restrição para a enzima BsaAI. Assim, quando o fragmento amplificado é clivado com essa enzima, dois fragmentos podem ser identificados no alelo mutante (333 e 280 pb), enquanto o alelo não mutante permanece intacto (613 pb), o que permite a identificação de genótipos heterozigotos (Figura 2).As progênies RC1F1 foram geradas a partir de 3 cruzamentos, tendo como parental doador do gene bmr6 o genótipo Tx2784 bmr6. Os parentais recorrentes foram linhagens R elite do Programa de Melhoramento de Sorgo da Embrapa, apresentando alta biomassa: CMSXS651, CMSXS650, CMSXS652.As plantas RC1F1 foram semeadas em dois vasos, cada vaso contendo 10 plantas. O DNA genômico foi extraído de amostras de folhas, duas semanas após o plantio. A extração de DNA foi feita utilizando-se o equipamento GenoGrinder 2000, segundo o protocolo descrito por Lana et al. (2010). A amplificação por PCR e a clivagem com a enzima de restrição BsaAI dos fragmentos amplificados foram feitas segundo descrito por Sattler et al. (2009). Os resultados da triagem para o gene mutante bmr6 estão ilustrados na Figura 2, onde 9 das 20 plantas de cada cruzamento RC1F1 podem ser visualizadas após análise eletroforética em gel de agarose. Cada um dos três retrocruzamentos apresentou segregação muito próxima do esperado, proporção de 1:1 de plantas dominantes homozigotas (Bmr6/Bmr6) para plantas heterozigotas (Bmr6/bmr6), sendo identificados de 4 a 5 plantas heterozigotas por vaso. As plantas heterozigotas identificadas foram então selecionadas para dar prosseguimento ao ciclo 2 de retrocruzamento (RC2). Plantas RC2F1, a serem desenvolvidas em etapas futuras do trabalho, também serão analisadas com o marcador CAPS para o gene bmr6 a fim de acelerar a introgressão da característica nervura marrom em genótipos elite de sorgo de alta biomassa. 4 Validação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido Figura 1. A) Via sintética da lignina indicando a enzima CAD, cujo gene mutante confere a característica nervura marrom (bmr6). B) Teores de lignina na cultivar TX2784R e a mesma cultivar com o alelo bmr6 introgredido, conferindo redução do conteúdo de lignina em cerca de 50%. C) Mutante de sorgo bmr6 mostrando nervura marrom característica.  5Validação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido ConclusãoO uso de marcador molecular CAPS específico para o alelo mutante bmr6 pode auxiliar na obtenção mais rápida e eficiente de materiais de sorgo biomassa destinados à produção de etanol de segunda geração. A partir dessa análise será possível selecionar novas progênies R de sorgo biomassa contendo o alelo bmr6, que serão utilizadas para produção de híbridos ou novas cultivares.Como os genes mutantes bmr12 e bmr18 possuem marcadores moleculares disponíveis, estes serão, em breve, também introgredidos em materiais elite de sorgo do Programa de Melhoramento da Embrapa, aumentando a disponibilidade de materiais com potencial para ocuparem o novo nicho de mercado de etanol de segunda geração.A tecnologia de produção de etanol de segunda geração poderá ser importante no futuro para incrementar a produção doméstica de biocombustíveis sem a necessidade de expansão de fronteiras agrícolas nacionais. Sendo assim, é muito importante desenvolver culturas destinadas a esse fim, como o sorgo biomassa.ReferênciasCHEN, F.; DIXON, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. 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Após clivagem com BsaAI, apenas o fragmento do alelo mutante bmr6 resultou em dois fragmentos de 333 e 280 pb, permanecendo o alelo não mutante intacto. Plantas heterozigotas estão identificadas por um asterisco. B) Sequência mostrando a transição C-T que resultou na mutação do alelo bmr6 e o sítio de clivagem da enzima BsaAI.6 Validação de Marcadores Moleculares para Introgressão da Característica Nervura Marrom (bmr6) em Linhagens de Sorgo Biomassa Utilizando Retrocruzamento Assistido sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) lines with reduced lignin contents. BioEnergy Research, Lincoln, v. 2, p. 153-164, 2009.FERREIRA, P. D. S.; GONÇALVES, L. C.; JAYME, D. G.; PIRES NETO, O. S.; TOMICH, T. R.; FARIA JÚNIOR, W. G. As ligninas e a mutação bmr em plantas de milho e sorgo: revisão de literatura. Caderno de Ciências Agrárias, v. 4, p. 27-34, 2012.JORDAN D. B.; BOWMAN, M. J.; BRAKER, J. D.; DIEN, B. S.; HECTOR, R. E.; LEE, C. C.; MERTENS, J. A.; WAGSCHAL,  K. Plant cell walls to ethanol. 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MG 424 km 45 Caixa Postal 151CEP 35701-970  Sete Lagoas, MG Fone: (31) 3027 1100Fax: (31) 3027 1188E-mail: sac@cnpms.embrapa.br1a edição1a impressão (2012): on linePresidente: Presidente: Sidney Netto Parentoni. Secretário-Executivo: Elena Charlotte Landau. Membros: Flávia Cristina dos Santos Flávio Dessaune Tardin, Eliane Aparecida Gomes, Paulo Afonso Viana, Guilherme Ferreira Viana e Rosângela Lacerda de Castro.Revisão de texto: Antonio Claudio da Silva Barros.Normalização bibliográfica: Rosângela Lacerda de Castro. Tratamento das ilustrações: Tânia Mara A. Barbosa. Editoração eletrônica: Tânia Mara A. Barbosa.  Comitê de publicaçõesExpedienteCircular Técnica, 184VERMERRIS, W.; SABALLOS, A.; EJETA, G.; MOSIER, N. S.; LADISCH, M. R.; CARPITA, N. C. Molecular breeding to enhance ethanol production from corn and sorghum stover. Crop Science, Madison, v. 47, n. S3, p. S142-S153, 2007.

Validação de marcadores moleculares para introgressão da característica nervura marrom (bmr6) em linhagens de sorgo biomassa utilizando retrocruzamento assistido.

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