BIZZO, H. R.

OIANO NETO, J.

PINTO, M. A. S.

SOUZA, A. M. de

Infoteca-e

64ISSN 0103-5231Dezembro, 2010Rio de Janeiro, RJ1Metodologia para tratamento declorofórmio comercial para usoem separações cromatográficasJoão Oiano Neto1Humberto Ribeiro Bizzo2Marco Antonio Silva Pinto3Andressa Moreira de Souza41Químico, D.Sc. em Química Orgânica, pesquisador da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,oiano@cppse.embrapa.br2Químico Industrial, D.Sc. em Química Orgânica, pesquisador da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,bizzo@ctaa.embrapa.br3Farmacêutico, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ, marcoasp@ctaa.embrapa.br4Química, M.Sc. em Química, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,andressa@ctaa.embrapa.brIntroduçãoO clorofórmio ou triclorometano (CCl3; M. M. 119,39g/mol; bp1atm 61-62oC; d20 1,484 g/mL) é um solventeorgânico amplamente utilizado em várias áreas depesquisa como química, fitoquímica, bioquímica,biologia molecular, etc. (WINDHOLZ et al., 1983).Caracteriza-se como um líquido incolor, não inflamável,altamente volátil, irritante aos olhos e pele, nocivo seinalado ou ingerido, sendo classificado comocarcinogênico pela Environmental Protection Agency -EPA (WINDHOLZ et al., 1983).Pode se decompor na presença de luz, agentesoxidantes, ácidos e bases fortes, magnésio, sódio elítio metálicos produzindo gás cloro, fosgênio oucloreto de carbonila (COCl2, M. M. 98,92g/mol -explosivo) e ácido clorídrico (HCl) (SIGMA-ALDRICH,2009). É comercializado em frasco âmbar eestabilizado com 0,5-1% de etanol ou 100-300ppm deamileno quando a pureza é de 99,8% (WINDHOLZ etal., 1983).Industrialmente, o clorofórmio é produzido pelacloração do metano e esta reação ocorre sobaquecimento a 400-500oC via mecanismo radicalar(WINDHOLZ et al., 1983). A formação de clororadicalar leva à cloração sucessiva do cloroalcanopresente, dando origem a uma mistura decloroalcanos: diclorometano (M. M. 84,94g/mol; bp1atm39,75oC), clorofórmio e tetracloreto de carbono (M.M. 153,84g/mol; bp1atm 76,7oC) (Figura 1).Figura 1: Reações de formação da mistura decloroalcanos a partir do cloro gasoso e metano sobaquecimento.2 Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.A solubilidade do clorofórmio em água a 25oC é de1:200 (v/v) CHCl3:H2O, formando com esta umazeótropo a 56,12oC (MORITA; ASSUMPÇÃO, 2001;WINDHOLZ et al., 1983).O fosgênio presente no clorofórmio reage lentamentecom água e álcalis, sendo eliminado pela agitação comsolução alcalina. No entanto, devido à alta reatividadedo clorofórmio à luz e ao oxigênio, a eliminaçãocompleta do fosgênio não é obtida (MORITA;ASSUMPÇÃO, 2001).Um processo simples de purificação do clorofórmiocomercial envolve as etapas de lavagem com águapara remover o etanol utilizado como estabilizante,secagem com cloreto de cálcio, refluxo sob pentóxidode fósforo e posterior destilação (PERRIN;ARMAREGO, 1988).Outro método de purificação envolve a agitação compequenas quantidades de ácido sulfúrico concentrado,lavagem com água, secagem com cloreto de cálcio,filtração e posterior destilação (PERRIN; ARMAREGO,1988).O objetivo deste trabalho foi desenvolver umametodologia alternativa para o tratamento declorofórmio, de forma rápida e barata, sem envolvermuitas etapas e o consumo de vários reagentes.ExperimentalAmostrasDez litros de clorofórmio grau P. A., fora do prazo devalidade, armazenados no almoxarifado foramutilizados no processo de purificação.Devido ao caráter tóxico do clorofórmio, todamanipulação foi realizada em capela com exaustão,com a utilização de EPI´s (avental, óculos desegurança e luvas).Medida do pH do ClorofórmioA medida do pH do clorofórmio foi feita para verificara presença de ácido clorídrico (HCl). Para isso, fez-seuma partição com água ultrapura (grau Milli-Q, pH 6)na razão de 1:1 (v/v) e o pH da fase aquosa foi medidocom fita indicadora de pH (pH-fix 0-14 Macherey-Wagel®).A presença de ácido clorídrico foi indicada pela medidado pH da fase aquosa (pH 1), obtida após a partiçãocom o clorofórmio sem tratamento.Filtração em AluminaNesta etapa, os dez litros de clorofórmio foramfiltrados à pressão reduzida em um funil de vidro (d. i.11cm) com placa porosa, contendo um leito comaproximadamente 7,0cm de espessura e 410 gramasde alumina neutra Merck® 90 (63-200mesh) ativada a110oC em estufa por 24 horas (Figura 2).Figura 2. Sistema para filtração à pressão reduzida.(1) lã de vidro; (2) leito de alumina neutra; (3) funil devidro com placa sinterizada; (4) adaptador deborracha; (5) garra com suporte universal; (6)kitassato e (7) mangueira de vácuo.A lã de vidro é utilizada para evitar que a aplicação dosolvente, diretamente sobre o leito de alumina,danifique seu empacotamento.A etapa de filtração foi efetuada a fim de removerpossíveis contaminantes mais polares presentes noclorofórmio, assim como o próprio fosgênio.Após o processo de filtração, a alumina utilizada foirecuperada para posterior reutilização, mediantelavagem com metanol grau HPLC e água ultrapura. Emseguida, a alumina foi ativada a 110oC em estufa por24 horas.Neutralização com NaOHO clorofórmio, obtido após a filtração sob leito dealumina neutra, foi deixado sob agitação com lentilhasde hidróxido de sódio (NaOH) durante a noite paraneutralização do ácido clorídrico presente.Ao final deste período, o clorofórmio foi filtrado pararemoção das lentilhas e lavado com água grau Milli-Q(razão 1:1 v/v) sucessivamente até o pH da faseaquosa ser aproximadamente o mesmo da águaultrapura (pH 5 a 6).Em seguida, o solvente foi armazenado em frascoâmbar contendo sulfato de sódio anidro como agentesecante, sendo destilado em seguida.A lavagem com água visa, além de eliminar resíduosde fosgênio e álcali presentes, neutralizar oFoto: João Oiano Neto3Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.diclorocarbeno (:CCl2), espécie altamente reativa,formado durante a etapa de neutralização.Destilação fracionadaA destilação do clorofórmio foi realizada em umsistema de destilação fracionada semi automatizadomodelo NGW equipado com controle digital detemperatura de ebulição, coluna de destilação, mantade aquecimento, balão de fundo redondo, controladorde pressão e banho termostatizado para água derefrigeração.Utilizou-se uma razão de refluxo de 0,75 descartando-se a fração inicial (cabeça) e final (cauda) no processode destilação.Após a destilação, o clorofórmio, antes de serutilizado nas colunas cromatográficas abertas, foiarmazenado em frasco âmbar contendo 1% (v/v) deetanol grau HPLC como agente estabilizante.Análises por CG-EMEm todas as etapas do processo, uma amostra doclorofórmio foi coletada e submetida à análise por CG-EM.Utilizou-se um cromatógrafo a gás modelo Agilent®6890 e detector de massas Agilent® 5973N com fontede impacto eletrônico (EI) a 70eV.Na análise cromatográfica utilizou-se uma coluna daJ&W Scientific HP5 (5% fenil + 95% dimetilsilicone;30m x 0,25mm x 0,25um), volume de injeção 1mL emsplitless, Tinj. 250oC, Tini. 40oC, gradiente detemperatura 40-150oC a 5oC por min., depois 150-240oC a 10oC por min. e hélio como gás de arraste auma vazão de 1,0mL/min.Resultados e DiscussãoAnálise do Clorofórmio por CG-EMO cromatograma da análise do clorofórmio, semqualquer tipo de tratamento pode ser observado naFigura 3.comp osto s não identi ficados12 3 4CLOROFÓRMIOSEM TRATAMENTO1. Fosgênio2. Diclorometano3. Clorofórmio4. Tetracloreto de carbonoFigura 3. Cromatograma da análise por CG-EM doclorofórmio sem tratamento.Estas substâncias foram identificadas comparando-seos espectros de massas dos picos presentes nocromatograma das amostras de clorofórmio com osespectros de massas da biblioteca NIST doequipamento de CG-EM.Os valores de relação massa-carga (m/z) e a estruturapara cada fragmento utilizado na identificação dessassubstâncias estão descritos na Tabela 1.Tabela 1: Relação massa-carga (m/z) e estrutura dosfragmentos utilizados na identificação das substânciaspresentes nas amostras de clorofórmio.COMPOSTO RELAÇÃO M/Z FRAGMENTOFOSGÊNIO(COCl2; M. M. 98.92g/mol)63 [M-HCl35]+65 [M-HCl37]+DICLOROMETANO(CH2Cl2; M. M. 84,94g/mol)84 M+.49 [M-Cl35]+CLOROFÓRMIO(CHCl3; M. M. 119,39g/mol)119 M+.83 [M-HCl35]+47 [M-(HCl35)2]+TETRACLORETO DE CARBONO(CHCl4; M. M. 153,84g/mol)153 M+.117 [M-HCl35]+82 [M-H(35Cl)2]+Inicialmente o clorofórmio apresentou pH 1 na partiçãocom água, indicando uma alta concentração de ácidoclorídrico, sendo assim tratado com NaOH paraeliminar o ácido presente.Em estudos de separação cromatográfica de extratosvegetais, a presença de ácido em solventes comoclorofórmio, metanol e acetona, juntamente com oleito particulado de sílica gel, age como meio catalíticopara a geração de metabólitos (artefatos) que não sãooriundos do metabolismo secundário do vegetal.Estes artefatos são produzidos, principalmente, pelaocorrência de reações de hidrólise de ésteres eglicosídeos, O-metilação, clivagem de epóxidos,formação de acetonídeo, etc.O teor de fosgênio encontrado no clorofórmio semtratamento foi 1,23% e os teores de diclorometano etetracloreto de carbono foram 21,79% e 6,77%,respectivamente.Como observado nas Figuras 4 e 5, os processos defiltração sobre leito de alumina e a neutralização comNaOH eliminaram o fosgênio presente na amostra,assim como o ácido do meio. Além disso, tambémreduziram a concentração de outros contaminantes daamostra (compostos não identificados).4 Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.Figura 4. Cromatograma da análise por CG-EM doclorofórmio filtrado sob leito de alumina.1 2 3 CLOROFÓRMIO FILTRADO EM LEITO DE ALUMINA1.Diclorometano2.Clorofórmio3.Tetracloreto de carbono1 2 3 CLOROFÓRMIONEUTRALIZADOCOM NaOH1.Diclorometano2.Clorofórmio3.Tetracloretode carbonoFigura 5. Cromatograma da análise por CG-EM doclorofórmio após neutralização com NaOH.A análise do clorofórmio após a destilação (Figura 6)indicou a remoção dos contaminantes não eliminadosnas etapas anteriores. Porém, a destilação fracionada,com a razão de refluxo utilizada, não foi eficiente pararemover completamente o diclorometano e otetracloreto de carbono.Após essa etapa, os teores de diclorometano etetracloreto de carbono presentes no clorofórmioforam 21,06% e 3,25%, respectivamente.A destilação não alterou a porcentagem dodiclorometano presente no clorofórmio, porém reduziuem 48% o teor de tetracloreto de carbono em relaçãoà amostra inicial.123CLOROFÓRMIOAPÓS DESTILAÇÃOFRACIONADAFigura 6. Cromatograma da análise por GC-EM doclorofórmio após destilação.Análise Cromatográfica em Camada Fina(CCD)O tratamento de 10 litros de clorofórmio grau P. A.resultou em aproximados 8,5 litros de solvente a serutilizado nas separações em coluna cromatográficaaberta.Esse lote de clorofórmio tratado foi testado noLaboratório de CLAE como fase móvel na separaçãocromatográfica do extrato cetônico das sementes deCitrus sp. utilizando-se coluna aberta de baixapressão.Dessa separação em coluna foram obtidas váriasfrações contendo uma mistura de limonóides ealgumas destas frações foram analisadas em placasde sílica comparando-se o perfil cromatográfico obtidoquando a fase móvel continha o clorofórmio tratado nolaboratório e o clorofórmio grau HPLC Tedia® (Figura7).Como observado na figura abaixo, as amostrasapresentaram o mesmo perfil cromatográfico quantoao número de componentes presentes, assim como osmesmos valores de fator de retenção (Rf).Estes resultados mostram que não há diferença deseletividade na separação cromatográfica quando seutiliza o clorofórmio tratado em comparação aoclorofórmio comercial.Figura 7. Análise em placas de sílica das amostrascontendo misturas de limonóides utilizando clorofórmiotratado (a) e clorofórmio grau HPLC Tedia® (b). Fasemóvel hexano: clorofórmio: metanol 8:6:1 (v/v/v);revelação com vanilina: ácido acético: ácido sulfúrico.Em função da presença de água nos solventesorgânicos, as placas de sílica são muito susceptíveis àperda de seletividade e consequente resoluçãocromatográfica.Nesse caso, isso não foi observado mesmo tendo-seutilizado apenas sulfato de sódio como agente secanteantes da etapa de destilação, ao invés de pentóxido defósforo durante a destilação, como descrito por Perrine Armarego (1988).A presença desses dois solventes no clorofórmio não5Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.interferiu na eficiência de separação cromatográfica,visto que o tetracloreto de carbono estava empequena concentração, sendo um solvente apolar emrelação à sílica gel.O diclorometano, por outro lado, mesmo estando emmaior concentração (21,06%) também não alterou aforça da fase móvel, assim como a seletividade daseparação.Isto se deve ao fato do clorofórmio e o diclorometanoapresentarem constantes dielétricas (εo) oupolaridades relativas praticamente iguais (εodiclorometano0,30; εoclorofórmio 0,31) em relação à sílica gel.ConclusãoO método desenvolvido mostrou-se rápido e de fácilexecução, permitindo o tratamento de grandesquantidades do solvente em pouco tempo, com umrendimento aproximado de 85%.O clorofórmio obtido ao final desta metodologiaapresentou características apropriadas para serutilizado na purificação de extratos vegetais utilizandocromatografia.A recuperação e reutilização da alumina no processode filtração contribuem para a diminuição dos custosdesta metodologia.Além de contribuir para a redução dos custos com acompra de novos lotes de solvente, este procedimentogera uma significativa economia evitando o envio degrandes quantidades de material para descarte eincineração.ReferênciasMORITA, T.; ASSUMPÇÃO, R. M. V. Manual desoluções, reagentes e solventes: padronização,preparação, purificação. 11. ed. São Paulo: E. Blücher,2001. 629 p.PERRIN, D. D.; ARMAREGO, W. L. F. Purification oflaboratory chemicals. 3rd ed. O: Pergamon Press,1988. 391 p.SIGMA-ALDRICH. Material safety data sheet andproduct information sheet. Product number C2432 -chloroform. 2009. Disponível em: <http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/c2432pis.Par.0001.File.tmp/c2432pis.pdf >. Acessoem: 16 abr. 2010.WINDHOLZ, M.; BUDAVARI, S.; BLUMETTI, R. F.;OTTERBEIN, E. S. (Ed.). The Merck Index. 10th ed.Rahway: Merck, 1983.Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 3622-9600Fax: (0XX21) 3622-9713Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2010): tiragem (50 exemplares)Presidente:  Virgínia Martins da MattaMembros:   Renata Torrezan, Renata GalhardoBorguini, Marília Penteado Stephan, Marcos José deOliveira Fonseca, Daniela de Grandi Castro Freitas,André Luis N. Gomes, Luciana Sampaio de Araújo.Secretária:  Michele Belas CoutinhoSupervisão editorial:  Renata Galhardo BorguiniRevisão de texto: Janine Passos Lima da SilvaNormalização bibliográfica: Luciana S. de AraújoEditoração eletrônica:  Riane Rodrigues TovarComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 164Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 8583

Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.

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Metodologia para tratamento de clorofórmio comercial para uso em separações cromatográficas.

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