GODOY, R. L. de O.

GOUVÊA, A. C. M. S.

OIANO NETO, J.

PACHECO, S.

ROSA, J. S. da

SANTIAGO, M. C. P. de A.

Infoteca-e

62ISSN 0103-5231Dezembro, 2010Rio de Janeiro, RJ1Adaptação de um método porcromatografia líquida de altaeficiência para análise deantocianinas em suco de açaí(Euterpe oleraceae Mart.)Manuela Cristina P. de Araujo Santiago1Ana Cristina Miranda Senna Gouvêa2Ronoel Luiz de Oliveira Godoy3João Oiano Neto4Sidney Pacheco5Jeane Santos da Rosa61Engenheira Química, M.Sc. em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, analista da Embrapa Agroindústria deAlimentos, Rio de Janeiro, RJ, manuela@ctaa.embrapa.br2Farmacêutica, M. Sc. em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rio deJaneiro, RJ, acristinagouvea@hotmail.com3Farmacêutico, D.Sc. em Química Orgânica, pesquisador da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,ronoel@ctaa.embrapa.br4Químico, D.Sc. em Química Orgânica, pesquisador da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro, RJ,oiano@ctaa.embrapa.br5Químico, M.Sc. em Ciência e Tecnologia de Alimentos, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro,RJ, sidney@ctaa.embrapa.br6Química, M.Sc. em Ciência e Tecnologia de Alimentos, analista da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro,RJ, jeane@ctaa.embrapa.brIntroduçãoAs antocianinas, subclasse dos flavonóides,constituem um grupo de pigmentos solúveis em água,responsáveis pela maioria das cores de flores evegetais variando do vermelho ao azul (BROUILLARD,1982). Devido às suas propriedades antioxidantes, asantocianinas possuem importante papel na prevençãoou no retardamento do aparecimento de váriasdoenças (DOWNHAM; COLLINS, 2000; KUSKOSKI etal., 2004; MARTÍNEZ-FLÓREZ et al., 2002).Grande parte das pesquisas voltadas à extração,purificação, separação, identificação e quantificaçãodas antocianinas demanda equipamentos sofisticados,além de uma etapa longa de preparo da amostra. Osmétodos utilizados na separação e identificação dasantocianinas incluem cromatografia em papel,cromatografia em camada fina, cromatografia emcoluna, extração em fase sólida, cromatografia contra-corrente, espectrofotometria UV-visível,cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),espectrometria de massas (MS) e espectroscopia deressonância magnética e nuclear (RMN) (SKREDE;WROLSTAD, 2002; TAKEOKA; DAO, 2002).As antocianinas são muito solúveis em solventes2 Adaptação de um método por cromatografia líquida de alta eficiência para análise de antocianinas em suco de açaí (Euterpe oleraceae Mart.)polares, sendo extraídas com facilidade em água,metanol e etanol. Com o intuito de prevenir a oxidaçãodestes pigmentos, a extração é realizada em meioácido (LEE; HONG, 1992).Apesar da sua toxicidade, o metanol é o solvente maisutilizado na extração das antocianinas. Com o uso damistura etanol e água, observa-se uma menoreficiência na extração destes pigmentos. Em termosquantitativos, o metanol é 20% mais eficiente que oetanol, sendo este utilizado somente quando o aspectoquantitativo não é importante (TERCI, 2004).A metodologia implementada pelo laboratório paradeterminação das antocianinas é efetuada via CLAE,baseada no método descrito por Brito et al. (2007)para amostras liofilizadas. Como a maior demanda dolaboratório é a análise de amostras líquidas, tornou-senecessário realizar algumas adaptações e alteraçõestanto na etapa de extração quanto na cromatográficado método original, a fim de se adaptar o mesmo paraa matriz de interesse.Desta forma, este trabalho teve como objetivodescrever as modificações feitas no método original,tendo sido suco de açaí (Euterpe oleraceae Mart.)utilizado como a matriz testada durante os ensaios(Figura 1).Figura 1. Foto de açaí Foto: Virgínia Martins da MattaAdaptações e alteraçõesNo método descrito por Brito et al. (2007) sãopesados, na etapa de extração, 100mg de amostraliofilizada em um tubo com tampa de rosca apropriadopara utilização em centrífuga.  Em seguida, adiciona-seao tubo 2,0mL de solução de ácido fórmico 10% emmetanol com agitação durante 1 minuto, leva-se aoultrasom por 10 minutos e posteriormente centrifuga-se a 3000g e 20ºC por 10 minutos. Transfere-se osobrenadante para um balão volumétrico de 10,0mL,repetindo-se o processo de lavagem descrito acimacom o precipitado obtido na centrifugação, até osobrenadante obtido não apresentar a coloraçãocaracterística. Segundo relatado no método, trêslavagens são suficientes para a extração total dasantocianinas, podendo variar de acordo com aconcentração das mesmas na matriz utilizada. Apósas sucessivas extrações, completa-se para 10,0mL ovolume do balão volumétrico com ácido fórmico 10%em metanol. Filtra-se 1,0 mL desta solução emmembrana hidrofílica do tipo Millex® (0,45um),evapora-se o solvente sob fluxo de nitrogênio até asecura e em seguida ressuspende-se com a mesmaquantidade (1,0mL) de metanol 10% em ácido fórmico10%. O extrato ressuspendido é transferido para umvial e levado ao injetor do cromatógrafo.Para a utilização deste método com matrizes líquidas,no caso suco de açaí, foram testadas alíquotas devariados volumes na etapa de extração, a fim de seobter um extrato onde a concentração de antocianinasproporcionasse picos de boa magnitude na análisecromatográfica. Também era importante que aalíquota utilizada não dificultasse a etapa de lavagemdo extrato com uma possível saturação do mesmo.Por fim, passou-se a utilizar alíquotas de 1mL do sucode açaí. Foi possível observar, que no caso de setrabalhar com sucos de outros frutos, esta alíquotavariará de acordo com a concentração de antocianinasno meio.A etapa de filtração do extrato por membrana descritano método original foi retirada após avaliações visuaise cromatográficas que identificaram perdas deantocianinas neste processo (Figura 2). Diante doexposto, a etapa de filtração foi substituída por umade microcentrifugação para retirar possíveis partículasem suspensão que pudessem danificar a colunacromatográfica.Figura 2. Retenção das antocianinas em membrana dotipo Millex® (0,45um)Foto: Ana Cristina Miranda Senna Gouvêa3Adaptação de um método por cromatografia líquida de alta eficiência para análise de antocianinas em suco de açaí (Euterpe oleraceae Mart.)Solvente B  (metanol) Tempo de análise (minutos)  5-15% 0-20 15-25% 20-35 25-5% 35-40 5% 40-45  A análise cromatográfica foi realizada em umequipamento de cromatografia líquida de alta eficiênciaWaters® Alliance modelo 2690/5, com detector dearranjo de fotodiodos Waters® modelo 2996, softwareEmpower®, coluna Symmetry® C18 (4,6 x 150mm,3,5um), fluxo de 1,0mL/min e 50uL de injeção.A etapa cromatográfica foi adaptada visando diminuir otempo da análise, possibilitando assim a realização deum maior número de análises ao longo do dia. Alémdisto, também foram acrescentados procedimentos aesta etapa para preservação do sistemacromatográfico.A primeira alteração ocorreu no gradiente utilizado naeluição, o qual foi adaptado para um tempo de análiseigual a 45 minutos, enquanto que no método original erade 55 minutos (Tabela 1).Ao longo dos testes, observou-se que os tempos deretenção dos picos apresentavam pequenas variaçõesentre as injeções. Uma das explicações encontradaspara tal fenômeno é o fato de que 5 minutos pararetornar a coluna às condições iniciais da análise, istoé, composição da fase e equilíbrio da coluna, não eramsuficientes. Com isto, no novo gradiente proposto,utilizou-se um tempo de 5 minutos para retornar àscondições iniciais, além de 5 minutos de permanêncianas mesmas condições para assegurar o equilíbrio dacoluna.Tabela 1. Adaptação do gradiente de composição dafase móvelA temperatura da coluna foi outro fator alterado emrelação ao método usado por Brito et al. (2007). Atemperatura na qual a coluna é acondicionada passoude 20ºC para 30ºC. Nesta temperatura não ocorredegradação das antocianinas, além de influenciar naredução do tempo de retenção dos picos, porcontribuir com o aumento da cinética de eluição. Valeressaltar que manter a coluna a uma temperaturaconstante, sem oscilações, é extremamenteimportante para a estabilização da mesma.A limpeza do sistema cromatográfico (tubulações,válvulas, etc.), após o término de uma análise, éfundamental para a preservação do mesmo. Observou-se no decorrer das análises que o ácido fórmico,mesmo sendo indicado na literatura como um dosácidos que menos agride o sistema cromatográfico,provocou a corrosão de algumas partes metálicas dosistema, gerando pontos de vazamentos. No métododescrito por Brito et al. (2007), não é feita nenhumamenção quanto à limpeza do sistema. Com isso,adotou-se como procedimento, após o término de umasequência de injeções, a limpeza do sistema porperíodo longo (no mínimo 3 horas) com água grau Milli-Q, lavando-se em seguida o sistema com metanol grauHPLC.A adaptação da etapa de extração para amostraslíquidas mostrou-se satisfatória, uma vez que apóstrês lavagens não se observou mais alteração na cordo extrato obtido, indicando que todas as antocianinaspresentes foram extraídas até a terceira lavagem.Além disso, os cromatogramas obtidos apresentaramexcelente resolução e magnitude (Figura 3),viabilizando a aplicação das novas condições inclusiveem separações preparativas. Desta forma, foi possívelconstatar que as adaptações e alterações feitas,tanto na etapa de extração quanto na análisecromatográfica, proporcionaram um bom resultadopara este tipo de matriz.Figura 3. Cromatograma de amostra líquida de açaí.ReferênciasBRITO, E. S. de; ARAUJO, M. C. P. de; ALVES, R. E.;CARKEET, C.; CLEVIDENCE, B. A.; NOVOTNY, J. A.Anthocyanins present in selected tropical fruits:4 Adaptação de um método por cromatografia líquida de alta eficiência para análise de antocianinas em suco de açaí (Euterpe oleraceae Mart.)Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 3622-9600Fax: (0XX21) 3622-9713Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2010): tiragem (50 exemplares)Presidente:  Virgínia Martins da MattaMembros:   Marcos José de Oliveira Fonseca, MaríliaPenteado Stephan, Renata Torrezan, Renata GalhardoBorguini, Daniela de Grandi Castro Freitas, LucianaSampaio de Araújo,André Luis do NascimentoGomes e Michele Belas CoutinhoSupervisão editorial:  Renata Galhardo BorguiniRevisão de texto: Edmar das Mercês PenhaNormalização bibliográfica: Luciana S. de AraújoEditoração eletrônica:  André Luis do N. Gomes eMarcos MoulinComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 162CGPE 8581acerola, jambolão, jussara, and guajiru. Journal ofAgricultural and Food Chemistry, v. 55, n. 23, p.9389-9394, 2007.BROUILLARD, R. Chemical structure of anthocyanins.In: MARKAKIS, P. (Ed.).Anthocyanins as food colors. New York: AcademicPress, 1982. p.1-40.DOWNHAM, A.; COLLINS, P. Colouring our foods inthe last and next millennium. Journal of Food Scienceand Technology, v. 35, n. 1, p. 5-22, 2000.KUSKOSKI, E. M.; ASUERO, A. G.; GARCÍA-PARILLA, M. C.; TRONCOSO, A.M.; FETT, R.Actividad antioxidante de pigmentos antociánicos.Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 24,n. 4, p. 691-693, 2004.MARTÍNEZ-FLÓREZ, S.; GONZÁLEZ-GALLEGO, J.;CULEBRAS, J. M.; TUÑÓN, M. J. Los flavonoides:propiedades y acciones antioxidantes. NutriciónHospitalaria, v. 17, n. 6, p. 271-278, 2002.LEE, H. S.; HONG, V. Chromatographic analysis ofanthocyanins. 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