HUNGRIA, M.

SOUZA, R. C.

Infoteca-e

Diversidade de estirpes do gênero Burkholderia em solos do cerrado brasileiro baseado no sequenciamento do gene ribossomal 16SSOUZA, R.C.1,2; HUNGRIA, M2. 1Universidade Estadual de Londrina (UEL), Londrina, PR, 2Embrapa Soja, caixa postal, 231, 86001-970, Londrina, Paraná. e-mail: renata@cnpso.embrapa.br.IntroduçãoA região dos cerrados ocupa área contínua de 207 milhões de hectares, 20% do território nacional. Os solos do cerrado possuem características de alta acidez, alta saturação por alumínio e baixa concentração de nutrientes. (Adamoli et al., 1986). O solo é considerado um dos mais diversos habitats da Terra, onde em apenas um grama de solo contém milhares de bactérias, porém somente de 1 a 10% são conhecidas. (Hawksworth, 1991). No solo, também estão presentes bactérias do gênero Burkholderia que fazem parte da classe beta-Proteobacteria (Menard et al., 2007) e contém cerca de 30 espécies. Além do solo, algumas espécies são encontradas na água, incluindo água do mar, na rizosfera de plantas, em humanos, em várias espécies de animais e ambientes hospitalares (Coenye & Vandamme, 2003); além disso, podem ser de vida livre ou viver em simbiose ou em comensalismo com uma grande variedade de organismos (Payne et al., 2005). Algumas espécies de Burkholderia, pertencentes ao chamado complexo cepacia, estão envolvidas em doenças e compreendem pelo menos nove espécies de bactérias Gram-negativas, não formadoras de esporos, (Mahenthiralingam et al., 2005). Por exemplo, burkholderias do complexo cepacia podem causar sérias infecções em pessoas com fibrose cística e outros indivíduos vulneráveis (Mahenthiralingam et al., 2005; Menard et al., 2007) além de doenças em animais e plantas (Payne et al., 2005). Porém, outras espécies, estão sendo usadas para várias finalidades, incluindo controle biológico de patógenos de plantas, biorremediação de xenobióticos recalcitrantes (Coenye & Vandamme, 2003), promoção do crescimento em plantas (Estrada-De Los Santos et al., 2001), e fixação biológica do nitrogênio (Menard, et al., 2007). No entanto, o conhecimento da diversidade e distribuição de burkholderias simbiontes de leguminosas, bem como de sua ecologia, é ainda muito limitado e fragmentado (Garau et al., 2008). Desse modo o objetivo desse trabalho foi determinar a diversidade de bactérias do gênero Burkholderia em solos do cerrado brasileiro através do sequenciamento do gene ribossomal 16S.Materiais e MétodosForam utilizadas 17 estirpes provenientes de solos do Cerrado brasileiro isoladas do feijoeiro. As bactérias foram purificadas e, em seguida, repicadas em meio de cultura YM, a 28°C, confirmado quanto à pureza, pelo método do esgotamento (Vincent, 1970). O DNA das estirpes foi extraído, quantificado e amplificado pela técnica de PCR (“polymerase chain reaction”) com os “primers” que flanqueiam o gene 16S rRNA. fD1 5’ccgaattcgtcgacaacAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ e rD1 5’cccgggatccaagcttAAG GAG GTG ATC CAG CC 3’ (Weisburg et al., 1991). Os produtos de amplificação por PCR foram purificados com o uso do kit Invitrogen PureLink™ PCR purification e depois submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% para verificação visual dos fragmentos.  141V Jornada Acadêmica da Embrapa SojaFoi feita uma reação de PCR para sequenciamento utilizando DYE (DYEnamic ETterminator reagent premix for the MegaBACE, Amershan Biosciences) e as amostras submetidas a um aparelho sequenciador MegaBACE 1000 DNA Analyses System (Amershan Biosciences). Em seguida foram analisadas com o auxílio dos programas “phred”, “phrap” e “Consed”, que para se obter uma alta qualidade destas seqüências, estas foram agrupadas em “contigs”. As sequencias obtidas foram comparadas com outras sequencias do banco de dados GenBank do NCBI baseando-se em similaridade de sequências de nucleotídeo. Para as análises, as sequências obtidas foram alinhadas com uso do programa ClustalX versão 1.83, e comparadas com as estirpes tipo “type strain”. Para análises filogenéticas foram construídas árvores filogenéticas geradas com o uso do programa MEGA versão 4.0 (Kumar et al., 2004) com análises de Neighbor Joining (NJ), e para dar um suporte estatístico para a árvore, esta foi avaliada com análise de bootstrap com 1000 repetições. Também foram realizadas análises de similaridade genética das sequências do gene ribossomal 16S resultantes do seqüenciamento das 17 estirpes de bactérias no programa Bionumerics, utilizando o algoritmo UPGMA (unweightedd pair-group method with arithmetic mean). Resultados e DiscussãoNa árvore filogenética do gene ribossomal 16S foram formados dois grupos, sendo que o grupo II foi subdividido em dois subgrupos. A estirpe Caulobacter crescentus CB15T foi utilizada como “outgroup”, isto é, referência como estirpe distante geneticamente das estirpes do estudo. Onze estirpes tipo do gênero Burkholderia: B. unamae, B. nodosa, B. tropica, B. mimosarum, B. ferrariae, B. sacchari, B. kururiensis, B. caribensis, B. vietnamiensis, B. cepacia e B. phenazinium foram posicionadas no grupo I, junto com dez estirpes selecionadas do Cerrado, 1361, 1379, 1388, 1354, 1389, 1391, 1288, 1228, 1294 e 1213 (Fig.1). Com exceção da estirpe 1213 que apresentou 99% de similaridade com a estirpe Burkholderia ferrariae, todas apresentaram 100% de similaridade com Burkholderia nodosa.  No dendograma as estirpes pertencentes ao grupo I na árvore filogenética, foram agrupadas no grupo V com uma similaridade de 95,03% com B. nodosa (fig. 2). No grupo II da árvore filogenética, foram agrupadas as estirpes do gênero Rhizobium, e dois subgrupos foram observados. No subgrupo II.I, as estirpes 1207, 1312 e 1334 foram agrupadas com a estirpe tipo de Rhizobium radiobacter, com um bootstrap de 100%, mostrando ter maior semelhança genética com este (fig. 1). A partir da pesquisa no banco de dados NCBI, as estirpes 1312, 1334 e 1207, apresentaram 99% de similaridade com Rhizobium radiobacter. Esse agrupamento também foi confirmado usando o algoritmo UPGMA, e as estirpes do subgrupo II.I da árvore filogenética ficaram agrupados no grupo III do dendograma, apresentando 99,07% de similaridade com R. radiobacter (fig. 2). No subgrupo II.II da árvore com o método Neighbour-Joining as estirpes 142, 1315 e 1326 foram agrupadas com a estirpe tipo de R. tropici CIAT 899, e com R. rhizogenes, contudo, mostraram maior semelhança genética com a estirpe de R. tropici, com suporte de bootstrap de 86% (fig. 1). Em alinhamento no NCBI, essas estirpes apresentam 100% de similaridade com R. tropici. Na análise com algoritmo UPGMA essas estirpes ficaram agrupadas no grupo I do dendograma, com 99,2% de similaridade com R. tropici. A estirpe 1318 foi agrupada com R. etli, com um suporte de bootstrap de 97%, e 100% de similaridade utilizando a ferramenta BLASTN. No dendograma com o algoritmo UPGMA essa mesma estirpe (1318) apresentou 99,35% de similaridade com R. etli sendo agrupada no grupo II (fig. 2). Diversas espécies de Burkholderia ocupam múltiplos nichos, podendo ser patógenos ou simbiontes de plantas e, também, patógenos oportunistas em humanos (Coenye & Vandamme, 2003). A maioria das espécies de Burkholderia deste trabalho, no entanto, são conhecidas como 142 Embrapa Soja. Documentos, 323Figura 1 - Filogenia da árvore baseada no gene ribossomal 16S, com 17 estirpes provenientes dos solos do Cerrado brasileiro. Foram utilizadas em conjunto, na análise, estirpes representativas das espécies mais próximas (type strain; o número de acesso no GenBank consta do item de material e métodos). A árvore foi gerada usando a versão MEGA 4.0 e como modelo algorítmico o método Neighbour-Joining.1361 138913881354128813911379122888812941213Burkholderia mimosarum PAS44TBurkholderia ferrariae FeGl01Burkholderia sacchari  IPT10 T65G.I9313Burkholderia kururiensis KP23T345Burkholderia unamae SCCu-23Burkholderia nodosa Br3437T494Burkholderia tropica Ppe8TBurkholderia vietnamiensis LMG 10929TBurkholderia cepacia ATCC25416TBurkholderia phenazinium  ATCC 33666T509951Burkholderia caribiensis MWAP64T4414213341207Rhizobium radiobacter C58TRhizobium huautlense SO2TRhizobium etli CFN 42T1318Rhizobium rhizogenes LMG 152T1312Rhizobium tropici CIAT 899T131587100 G.II.48100 G.II976688100 G.II.I86132689Caulobacter crescentus CB15T0.1bactérias do solo, no qual exibem diferentes tipos de interações não patogênicas com as plantas. A fixação biológica do nitrogênio com a formação de nódulos, foi descrita em algumas espécies como B. vietinamensis (Caballero-Mellado et al., 2006), B. kururiensis (Estrada-de los Santos et al., 2001) B. tuberum, B. phymatum (Vandamme et al., 2002), B. unamae (Caballero-Mellado et al., 2004), B. tropica (Reis et al., 2004) e B. xenovorans (Goris et al., 2004), e encontram-se agrupadas no grupo I da árvore filogenética (Fig. 1) e no grupo V do dendograma (Fig. 2), junto com as estirpes isoladas do solo do Cerrado, mostrando a evolução e a similaridade das estirpes isoladas com sua capacidade em formar nódulo e fixar nitrogênio, em comparação com as estirpes tipo. As estirpes B. nodosa e B. mimosarum são simbiontes efetivas do gênero Mimosa (Chen et al., 2005). 143V Jornada Acadêmica da Embrapa SojaConclusãoFoi observado a partir da analise do gene ribossomal 16S, que a diversidade inter-especifica dentro do gênero Burkholderia foi baixa, visto que todas elas agruparam-se no mesmo grupo, tanto na árvore filogenética, quanto no dendograma, resultado da alta similaridade entre elas. As outras estirpes isoladas apresentaram baixa similaridade com o grupo das burkholderias, se agrupando dentro do grupo do gênero Rhizobium. Figura 2 – Dendograma obtido pela análise da sequência do gene 16S de 17  estirpes de bactérias, além de algumas estirpes tipo. Foi utilizado o algorítimo UPGMA (unweightedd pair-group method with arithmetic mean) no programa Bionumerics.Pairwise (OG:100%,UG:0%) (FAST:2,10) Gapcost:0%16S82 86 88 908010094 96 989284131513261312Rhizobium tropici CIAT 899TRhizobium rhizogenes LMG 152T1318Rhizobium etli CFN 42TRhizobium huautlense SO2T12071334142Rhizobium radiobacter C58TBurkholderia mimosarum PAS44TBurkholderia sacchari IPT10 T1288135413791388138913911213122812941361Burkholderia nodosa Br3437TBurkholderia ferrariae FeG101TBurkholderia tropica Ppe8TBurkholderia unamae SCCu23TBurkholderia kururiensis KP23TBurkholderia phenazinium  ATCC33666TBurkholderia caribiensis MWAP64TBurkholderia vietnamiensis LMG 10929TBurkholderia cepacia ATCC25416T................................G.IG.IIG.IIIG.IV.G.144 Embrapa Soja. Documentos, 323Referências ADAMOLI, J.; MACÊDO, J.; AZEVEDO, L. G.; NETTO, J. M. Caracterização da região dos Cerrados. In: GOEDERT, W. J. Solos dos Cerrados, tecnologias de manejo. São Paulo: Editora Nobel, 1986. p.33-74.CABALLERO-MELLADO, J.; MARTÍNEZ-AGUILAR, L.; PAREDES-VALDEZ, G.; ESTRADA DE LOS SANTOS, P. Burkholderia unamae sp Nov., na N2-fixing rhizospheric and endophytic espécies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.54, p.1165-1172, 2004.CABALLERO-MELLADO, J.  Microbiología agrícola e interacciones microbianas con plantas.  Revista Latinoamericana de Microbiologia, v. 48, n. 2, p.154-161, 2006.  Disponível em: http://<www.bashanfoundation.org/gmaweb/pdfs/microbiologiaagricola.pdf>. Acesso em:  23 jul. 2010.CHEN, W.-M.; FARIA, S. M.; STRALIOTTO, R.; PITARD, R. M.; SIMÕES-ARAUJO, J. L.; CHOU, Y. J. Proof that Burkholderia forms effective symbioses with legumes: a study of novel mimosa-nodulating strains from South America. Applied and Environmental Microbiology v.71, p.7461-7471, 2005. COENYE, T.; VANDAMME, P. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environmental Microbiology, v.5, p.719-729, 2003.ESTRADA DE LOS SANTOS, P.; BUSTILLOS-CRISTALES, R.; CABALLERO-MELLADO, J. Burkholderia, a genus rich in plant-associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution. Applied and Environmental Microbiology, v.67, n.6, p.2790-2798, 2001.GARAU, G.; YATES, R. J.; DEIANA, P.; HOWIESON, J. G. Novel strains of nodulating Burkholderia have a role in nitrogen fixation with papilionoid herbaceous legumes adapted to acid, infertile soils. Soil Biology & Biochemistry, p1-10, 2008. GORIS, J.; DE VOS, P.; CABALLERO-MELLADO, J.; PARK, J. H.; FALSEN, E.; qUENSEN, J. F.; TIEDJE, J. M.; VANDAMME, P. Classification of the PCB- and biphenyl-degrading strain  LB400 and relatives as Burkholderia xenovorans sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.54, p.1677-1681, 2004.HAWKSWORTH, D.L. The biodiversity of microorganisms and invertebrates. It’s role in sustainable agriculture. In: HAWKSWORT, D.L. (Ed.), Importance of invertebrates and microorganisms as components of biodiversity. Melksham: CAB International: Redwood Press, 1991, p. 302.KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. Mega 3: integrated software for molecular evolutionary genetcs analysis and sequence alignment, Briefings in Bioinformatcs, v.5, p.150-163, 2004.MAHENTHIRALINGAM, E.; URBAN, T. A.; GOLDBERG, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nature, v.3, p.144-156, 2005.MENARD, A.; MONNEZ, C. ESTRADA DE LOS SANTOS, P.; SEGONDS, C.; CABALLERO-MELLADO, J. LIPUMA, J. J.; CHABANON, G.; COURNOYER, B. Selection of nitrogen-fixing deficient Burkholderia vietnamiensis strains by cystic fibrosis patients: involvement of nif gene deletions and auxotrophic mutations. Environmental Microbiology, v.9, n.5, p.1176-1185, 2007.PAYNE, G. W.; VANDAMME, P.; MORGAN, S. H.; LIPUMA, J. J.; COENYE, T.; WEIGHTMAN,  145V Jornada Acadêmica da Embrapa SojaA. J.; JONES, T. H.; MAHENTHIRALINGAM, E. Development of a recA gene-based identification approach for the entire Burkholderia genus. Applied and Environmental Microbiology, v.71,n.7, p.3917-3927, 2005.REIS, V. M.; ESTRADA DE LOS SANTOS, P.; TENORIO-SALGADO, S.; VOGEL, J.; STOFFELS, M.; GUYON, S.; MAVINGUI, P.; BALDANI, V. L. D.; SCHMID, M.; BALDANI, J. I.; BALANDREAU, J.; HARTMANN, A.; CABALLERO-MELLADO, J. Burkholderia tropica sp. nov., a novel nitrogen-fixing, plant-associated bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v.54, p.2155-2162, 2004.VANDAMME, P.; GORIS, J.; CHEN, WM.; DE VOS, P.; WILLEMS, A. Burkholderia tuberum sp. nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes. Systematic and Applied Microbiology, v.25, p.507-512, 2002.VINCENT, J.M. Manual for the practical study of root nodule bacteria. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1970. 164p. (IBP Handbook, 15).WEISBURG, W. G.; BARNS, S. M.; PELLETIER, D. A.; LANE, D. J. 16S Ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, v.173, n.2, p.697-703, 1991.

Diversidade de estirpes do gênero Burkholderia em solos do cerrado brasileiro baseado no sequenciamento do gene ribossomal 16S.

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/859390/1/ID30988.pdf

Diversidade de estirpes do gênero Burkholderia em solos do cerrado brasileiro baseado no sequenciamento do gene ribossomal 16S.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Infoteca-e