CAVALHEIRO, J. C. T.

MERCANTE, F. M.

OTSUBO, I. M. N.

PELEGRIN, R. de

Portuguese

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ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE RIZÓBIOS DE SOLOS DE MATO GROSSO DO SUL PARA INOCULAÇÃO EM FEIJOEIRO COMUM  Juliana Cristina Touro Cavalheiro(1), Ilda Miyuki Nakase Otsubo(1,2), Rodrigo de Pelegrin(1,2), Vladimir Andrei Tarasiuk(1), Aroldo da Silva Júnior(1), Fábio Martins Mercante(1) . (1)Embrapa Agropecuária Oeste, Cx. Postal 661, 79804-970, Dourados, MS, mercante@cpao.embrapa.br; (2)Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal (Uniderp), Dourados, MS.  Palavras-chave: Rhizobium, Phaseolus vulgaris, eficiência simbiótica, nodulação, leucena.  Introdução A importância social e econômica da cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) no Brasil é evidenciada pelo contingente de pequenos produtores, que a cultivam com baixo aporte de insumos, com crescente relevância para o agronegócio no país. A cultura ocupou, na safra 2004/2005, 3.812.800 ha, com uma produção de 3.044.400 toneladas, resultando num baixo rendimento médio nacional, de apenas 798 kg ha-1 (Agrianual, 2005). O baixo nível de tecnologia empregado e o cultivo em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N, contribuem fortemente para esse cenário. Conseqüentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com bactérias diazotróficas, de modo eficaz, representa uma alternativa para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, além de evitar a contaminação dos recursos hídricos pelo nitrato e de diminuir a emissão de gases com efeito estufa. Entretanto, diversos relatos têm mencionado a baixa nodulação e ausência de resposta à inoculação em ensaios a campo, levantando dúvidas sobre os benefícios que a inoculação com estirpes superiores pode oferecer (Graham, 1981; Pereira et al., 1984; Ramos & Boddey, 1987; Hardarson, 1993). Explicações para a falta de resposta à inoculação em alguns ensaios podem residir na população numerosa, mas ineficiente, de rizóbios na maioria dos solos (Graham, 1981; Thies et al., 1991). Além disso, a baixa freqüência de resposta à inoculação do feijoeiro em condições de campo tem sido atribuída à susceptibilidade de ambos parceiros simbióticos a diversos fatores ambientais, tais como temperaturas elevadas (Mercante, 1993; Hungria & Vargas, 2000), e à instabilidade genética das estirpes que haviam sido selecionadas anteriormente para o feijoeiro e que pertenciam à espécie Rhizobium leguminosarum (Hungria & Araujo, 1995). Por outro lado, diversos estudos têm mostrado que estirpes de R. tropici apresentam maior estabilidade genética e maior tolerância a temperaturas elevadas do que estirpes de R. leguminosarum bv. phaseoli (Martínez-Romero et al., 1991; Amaral, 1998; Pinto et al., 1998; Raposeiras et al., 2002). Os objetivos do presente estudo foram obter um banco de isolados de rizóbio provenientes de diferentes solos de Mato Grosso do Sul e avaliar a sua eficiência simbiótica em feijoeiro, sob condições controladas. Este estudo compreende a etapa inical de um programa de seleção de estirpes, que visa a obtenção de rizóbios mais eficientes, competitivos e estáveis geneticamente, para inoculação em feijoeiro.         Material e Métodos Os isolados de rizóbio foram obtidos de nódulos de plantas de Leucaena leucocephala (Lam.) R. de Wit., var. K-72, e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), cv. Carioca, crescidas em vasos de "Leonard" (Vincent, 1970). Cada vaso, contendo uma mistura de areia e vermiculita (1:1, v:v) foi esterilizado e, posteriormente, inoculado com 100 g de solo coletado em diversas regiões tradicionalmente produtoras de feijão em Mato Grosso do Sul. Inicialmente, plantas de feijoeiro foram cultivadas nos vasos de “Leonard” e, após 35-40 dias da germinação, as plantas foram colhidas, os substratos devolvidos aos respectivos vasos e os nódulos separados para o isolamento. Em seguida, plantas de Leucaena foram cultivadas nos mesmos vasos de “Leonard” até 65 dias após a semeadura, selecionando-se cerca de 20 nódulos em cada vaso, dos quais foram realizados os isolamentos de rizóbio. Para o isolamento das estirpes de rizóbio, os nódulos foram esterilizados superficialmente com uma solução de hipoclorito de sódio (10%) e os isolados obtidos, purificados em meio “yeast mannitol agar”- YMA (Vincent, 1970).    A eficiência simbiótica dos isolados de rizóbio foi avaliada em condições controladas de casa de vegetação, utilizando-se vasos de "Leonard" esterilizados, conforme descrito anteriormente. Nessa avaliação, culturas puras de rizóbio foram crescidas em meio YM (Vincent, 1970) a 30ºC, por três dias, com agitação. Cada semente foi inoculada com 0,5 mL de suspensão, contendo cerca de 108 células de rizóbio mL-1. Em todos os ensaios, foram incluídos tratamentos sem inoculação e outro recebendo apenas N-NH4NO3, que serviram de controle para comparação. Além disso, a eficiência dos isolados obtidos foi comparada com a eficiência das estirpes CIAT 899 e PRF 81, recomendadas para produção do inoculante comercial para o feijoeiro no Brasil. Durante o período de crescimento, as plantas foram supridas com solução nutritiva sem nitrogênio. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados, com três repetições. No início do florescimento, as plantas foram colhidas, sendo analisados parâmetros relacionados à nodulação e parte aérea das plantas. Características morfológicas, como o crescimento dos isolados em meio LB ("Luria-Bertani") e crescimento "in vitro" a 40ºC em meio de cultura YMA, também foram avaliadas.  Resultados e Discussão Leucaena leucocephala, var. K-72, e feijoeiro, cv. Carioca, foram utilizados para recuperar estirpes de rizóbio de solos de 34 municípios produtores de feijão do Estado de Mato Grosso do Sul e 01 município de Mato Grosso, abrangendo 87 locais diferentes. Conforme estudos anteriores, a recuperação de rizóbio do solo utilizando Leucaena leucocephala como “planta-isca” mostrou-se eficiente na obtenção de isolados mais estáveis geneticamente e com elevada capacidade simbiótica quando inoculada em feijoeiro (Mercante, 1993; Mercante et al., 1998).  Foram obtidos 1.526 isolados de rizóbio, sendo 65% oriundos de nódulos de leucena e 35% de nódulos de feijoeiro.  Avaliaram-se 351 isolados de rizóbio obtidos de nódulos de leucena e 147 isolados de feijoeiro quanto ao crescimento em meio LB ("Luria-Bertani") e crescimento "in vitro" a 40ºC. Do total dos isolados de nódulos de leucena, 60% cresceram em meio LB, dos quais cerca de 82% também cresceram a 40ºC. Por outro lado, dos isolados que não cresceram no meio LB (40%), apenas 32% apresentaram crescimento a 40ºC. Quanto aos isolados de nódulos de feijoeiro, 54% cresceram em meio LB, dos quais 90% também cresceram a 40ºC. Dos isolados que não cresceram em meio LB, cerca de 75% dos isolados também não cresceram a 40ºC. Tais resultados indicam uma elevada correlação entre o crescimento em meio LB e sua tolerância a temperatura de 40ºC. A eficiência simbiótica de 380 isolados de rizóbio obtidos de leucena e 147 isolados obtidos de feijoeiro foi avaliada sob condições controladas de casa de vegetação, em doze experimentos. Dos isolados de nódulos de leucena, cerca de 51, 74 e 72% foram mais eficientes do que a estirpe CIAT 899, quanto ao número de nódulos, peso de nódulos secos e produção de matéria seca da parte aérea das plantas, respectivamente. Do mesmo modo, a grande maioria destes isolados de rizóbio mostraram-se mais eficientes que a estirpe PRF 81, quando inoculados em sementes de feijoeiro. Entre os isolados de rizóbio obtidos de nódulos de feijoeiro, a maioria mostrou-se menos eficiente do que a estirpe CIAT 899. Nesse caso, a estirpe CIAT 899 mostrou-se mais eficiente do que 65, 54 e 61 % dos isolados de feijoeiro, quanto ao número de nódulos, matéria seca de nódulos e de parte aérea, respectivamente.  Conclusões 1. Um grande número de isolados de rizóbios nativos de solos de diversas regiões de Mato Grosso do Sul e obtidos de nódulos de leucena e feijoeiro demonstraram um grande pontencial simbiótico para inoculação em feijoeiro, abrindo perspectivas para a obtenção de inoculantes mais eficazes para esta cultura.   2. A recuperação de rizóbio do solo utilizando a leucena como planta-isca mostrou-se mais eficiente na recuperação de isolados com maior eficiência simbiótica com o feijoeiro, do que quando os isolados foram obtidos diretamente de nódulos de feijoeiro.  Referências Bibliográficas AGRIANUAL 2006: anuário da agricultura brasileira. São Paulo: Instituto FNP, p. 308, 2005.   AMARAL, E. S. Papel de plasmídeos em estirpes de Rhizobium que nodulam o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.): estabilidade, efetividade simbiótica e tolerância a estresses ambientais. 1998. 122 p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.  GRAHAM, P. H. Some problems of nodulation and symbiotic nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris L.: a review. Field Crops Research, Amsterdam, v. 4, p. 93-112, 1981.  HARDARSON, G. Methods for enhancing symbiotic nitrogen fixation. Plant and Soil, Dordrecht, v.152, 1-17, 1993.  HUNGRIA, M.; ARAUJO, R. S. Relato da VI Reunião de laboratórios para recomendação de estirpes de Rhizobium e Bradyrhizobium. In: HUNGRIA, M.; BALOTA, E. L.; COLOZZI-FILHO, A.; ANDRADE, D. S. (Ed.). Microbiologia do solo: desafios para o século XXI. Londrina: IAPAR: EMBRAPA-CNPSo, 1995. p. 476-489.  HUNGRIA, M.; VARGAS, M. A. T. Environmental factors impacting N2 fixation in legumes grown in the tropics, with an emphasis on Brazil. Field Crops Research, Amsterdam, v. 65, p. 151-164, 2000.  MARTÍNEZ-ROMERO, E.; SEGOVIA, E.; MERCANTE, F. M.; FRANCO, A. A.; GRAHAM, P. H.; PARDO, M. A. Rhizobium tropici, a novel species nodulating Phaseolus vulgaris L. beans and Leucaena sp. trees. International Journal of Systematic Bacteriology, Washington, v. 41, p. 417-426, 1991.  MERCANTE, F. M. Uso de Leucaena leucocephala na obtenção de Rhizobium tolerante a temperatura elevada para inoculação do feijoeiro. 1993. 149 f. Tese (Mestrado em Ciência do Solo) – Departamento de Solos, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.   MERCANTE, F. M.; CUNHA, C. O.; STRALIOTTO, R.; RIBEIRO JÚNIOR, W.; VANDERLEYDEN, J.; FRANCO, A. A. Leucaena leucocephala as a trap-host for Rhizobium tropici strains from the Brazilian "Cerrado" region. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, p. 49-58, 1998.  PEREIRA, P. A. A.; ARAUJO, R. S.; ROCHA, R. E. M.; STEINMETZ, S. Capacidade dos genótipos de feijoeiro de fixar N2 atmosférico. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v. 19, p. 811-815, 1984.  PINTO, P. P.; RAPOSEIRAS, R.; MACEDO, A. M.; SELDIN, L.; PAIVA, E.; SÁ, N. M. H. Effects of hight temperature on survival, symbiotic performance and genomic modifications of bean nodulating Rhizobium strains. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, p. 295-300, 1998.  RAMOS, M. L. G.; BODDEY, R. M. Yield and nodulation of Phaseolus vulgaris and the competitivity of an introduced Rhizobium strain: effects of lime, mulch and repeated cropping. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 19, p. 171-177, 1987.   RAPOSEIRAS, R.; PINTO, P. R.; PASSOS, R. V. M.; SELDIN, L.; PAIVA, E.; SCOTTI, M. R.; SÁ, N. M. H. Variability of isolated colonies in bean nodulating Rhizobium strains before and after exposure to hight temperature. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 33; p. 149-154, 2002.  THIES, J. E.; SINGLETON, P. W.; BOHLOOL, B. B. Influence of size of indigenous rhizobial populations on establishment and symbiotic performance of introduced rhizobia on field-grown legumes. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 57, p. 19-28, 1991.   VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root nodule bacteria. London: International Biological Programme, 1970. 164 p. (IBP Handbook, 15).  

Isolamento e seleção de rizóbios de solos de Mato Grosso Do Sul para inoculação em feijoeiro comum

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Isolamento e seleção de rizóbios de solos de Mato Grosso Do Sul para inoculação em feijoeiro comum

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