COSTA, M. R. T. da R.

Infoteca-e

Metodologia Científica para Extração de DNA de Amostras de Sangue (Aves e Quelônios)IntroduçãoA extração de DNA é o passo primordial para a sua utilização nas diferentes técnicas de marcadores moleculares. Essa etapa é muito importante, já que o DNA deve estar íntegro para que os objetivos sejam alcançados com sucesso. A quantidade de DNA necessária varia conforme o tipo de marcador molecular que será utilizado. Por exemplo, para uma reação de RAPD (Polimorfismos de DNA Amplifica-dos ao Acaso) são necessários alguns nanogramas de DNA, enquanto para análise RFLP, são necessá-rias quantidades de DNA na ordem de microgramas. Existem diferentes protocolos de extração de DNA, com variações de acordo com a espécie em questão e o tecido a ser utilizado, sendo de fundamental im-portância que o material coletado esteja bem preser-vado. Após a coleta, o material deve ser submetido a uma solução extratora cujos componentes variam de acordo com o protocolo, devendo conter um tampão para estabilizar o pH, um sal para dissociar as proteínas do DNA, um detergente para solubilizar as membranas e colaborar na atividade enzimática e um agente inativante de DNases com a função de proteger o DNA genômico.Esta metodologia foi desenvolvida no Laboratório de Genética Molecular da Embrapa Amazônia Oriental e promove a extração de DNA íntegro e próprio para utilizar em diferentes técnicas moleculares. O princi-pal ganho da tecnologia é a diminuição do tempo de extração. A seguir, estão descritos os passos a serem execu-tados:• Coletar amostras de sangue com EDTA, para evitar coagulação, em tubos de prolipropileno de 15 ml.• Conservar o material resfriado (-4 °C) até a extração, que deve se proceder no máximo até 3 dias após a coleta.• Transferir 100 µl a150 µl de cada amostra para tubos de 15 ml identificados.• Adicionar 4 ml de tampão STE, 250 µl de CTAB 10% pH 7,2 e 50 µl de ribonuclease (RNase A 10 mg/ml).• Adicionar 50 µl de proteinase K 20 mg/ml e incubar por 1 hora a 55 °C  em contínua agitação.• Misturar levemente em vórtex.Maria Rosa Travassos da Rosa Costa1228ISSN 1983-0505Outubro, 2011 Belém, PAIlustração: Vitor LôboTécnico1 Engenheira-agrônoma, doutora em Genética e Biologia Molecular, pesquisadora da Embrapa Amazônia Oriental, Belém, PA. mrco@cpatu.embrapa.brComunicado2 Metodologia Científica para Extração de DNA de Amostras de Sangue (Aves e Quelônios)• Levar os tubos à temperatura ambiente e adicionar 1 ml de NaCl 5 M. Agitar gentilmente por 15 segun-dos. Adicionar 3 ml de clorofórmio e realizar inversão contínua durante aproximadamente 3 minutos.• Centrifugar em centrífuga refrigerada a 5.000 rpm por 10 minutos.• Transferir o sobrenadante para tubos de 15 ml e adicionar volume igual de álcool isopropílico 95% gelado (-20 °C).• Inverter os tubos gentilmente para precipitar o DNA.• Centrifugar a 5.000 rpm por 5 minutos (4 °C).• Descartar o álcool.• Acrescentar 500 µl de álcool etílico a 70% para remover sais.• Verificar se há ocorrência de impurezas. Se houver, repetir a lavagem com álcool etílico 70%.• Retirar o álcool e secar na estufa a 55 °C por 1 hora (cuidado para não secar muito).• Ressuspender o DNA com 300 µl de tampão TE ou água ultrapura.• Guardar em geladeira a 4 °C até a quantificação.• Após a quantificação, estocar em freezer -80 °C. Figura 1. Quantificação das amostras. Nos 3 primeiros poços, encontra-se o DNA de Bacteriófago Lambda com 50 ng, 100 ng e 200 ng, respectivamente.Soluções utilizadas1- Tampão de extração STE (1.000 ml)• 20 ml de NaCl 5M.• 10 ml de Tris HCl 1M pH 8,0.• 10 ml de EDTA 0,1M pH 8,0.• Completar para 1.000 ml e autoclavar por 20 minu-tos.2- Solução de NaCl 5M (1.000 ml) Dissolver 292,2 g de NaCl em 800 ml de água estéril. Ajustar o volume para 1 litro com água es-téril. Dividir o volume em vasilhames, autoclavar e armazenar a 4 °C.3- Etanol 70% (1.000 ml) Diluir 736,8 ml de álcool comercial a 95% em 263,2 ml de água estéril.4- Tampão de extração TE (100 ml)• 1 ml de Tris-HCl 1M pH 8,0.• 1 ml de EDTA 0,1M pH 8,0.• Completar com água destilada para 100 ml e autocla-var por 20 minutos.5- CTAB (brometo de hexadeciltrimetilamonio) 20 % (100 ml) Adicionar 20 g de CTAB a 80 ml de água estéril. Aquecer até 60 °C a 80 °C para facilitar a dis-solução. Ajustar o volume para 100 ml com água estéril. Não é necessário esterilizar. Armazenar à temperatura ambiente.  6- EDTA (dissodium ethylenediaminetetra-acetate 2H2O) 0,5 M (1 litro)Adicionar 186,1 g de dissodium ethylenediaminete-tra-acetate 2H2O (EDTA) a 800 ml de água estéril. Agitar vagarosamente em agitador magnético. Man-tendo a solução sobre o agitador magnético, ajustar o pH para 8,0 com a adição de NaOH (aproximada-mente 20 g de NaOH peletizada). O sal dissódico EDTA não dissolve enquanto o pH da solução não se aproxima de 8,0. Dividir o volume em vasilhames de 250 ml, esterilizar por autoclavagem e armazenar a -4 0C.7- Ribonuclease A 10 mg/ml- (1 ml) Dissolver 10 mg de RNAse A em 1 ml de acetato de sódio 0,01M (pH 5,2). Ajustar o pH para 7,4 adicio-nando Tris HCl 1M pH 8,0. Aquecer até 100 0C por 15 minutos. Deixar esfriar lentamente à temperatura ambiente. Armazenar a -20 0C.8- Proteinase K – 50 µg/ml – Estoque-20 mg/mlSolução estoque: é calculada pela fórmula:Ci X Vi= Cf X Vf Em que:Ci= concentração inicial (verifica-se a concentração inicial na embalagem do produto).Vi= Volume inicial (volume inicial a ser pipetado).Cf= Concentração final (20 mg/ml).Vf= Volume final (quantidade de solução final que se deseja).Completa-se para o volume final com tampão TE 3Metodologia Científica para Extração de DNA de Amostras de Sangue (Aves e Quelônios)(ítem 4).Verificar sempre a equivalência das concentrações.O volume de tampão a ser usado na diluição é obti-do pela fórmula: (TxCFP)/(CIPx10)3, em que:T= Volume do tampão a ser usado (nº de amostras x 700 µl + 10 %).CFP= Concentração final da proteinase (50 µg/ml ).CIP= Concentração inicial da proteinase (20 mg/ml).Comunicado Técnico, 228Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Amazônia OrientalEndereço: Tv. Dr. Enéas Pinheiro, s/n.Caixa Postal 48. CEP 66095-100 - Belém, PA.Fone: (91) 3204-1000Fax: (91) 3276-9845www.cpatu.embrapa.brsac@cpatu.embrapa.br1a ediçãoVersão eletrônica (2011)CGPE 9761Comitê de PublicaçãoPresidente: Michell Olivio Xavier da CostaSecretário-Executivo: Moacyr Bernardino Dias-Filho Membros: Orlando dos Santos Watrin, Márcia Mascarenhas Grise, José Edmar Urano de Carvalho, Regina Alves Rodrigues, Rosana Cavalcante de OliveiraRevisão Técnica: Eduardo R. de C. Pinto – Embrapa Rec. Gen. e BiotecnologiaRodrigo da Rocha Fragoso – Embrapa CerradosExpediente Supervisão editorial: Luciane Chedid Melo Borges Revisão de texto: Narjara de Fátima G. da Silva PastanaTratamento das ilustrações: Vitor Trindade LôboEditoração eletrônica: Vitor Trindade Lôbo

Metodologia científica para extração de DNA de amostras de sangue (aves e quelônios).

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/920227/1/ComTec228.pdf

Metodologia científica para extração de DNA de amostras de sangue (aves e quelônios).

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Infoteca-e