MATTOS, K. K. de

MATTOS, P. S. R. de

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     Boletim de Pesquisa  27 e  Desenvolvimento ISSN 1981 - 609X Dezembro, 2010      Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus).                                  ISSN 1981 - 609XDezembro, 2010Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária                                                                                       Embrapa Roraima Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento          Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 27    Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus).   Paulo Sergio Ribeiro de Mattos   Keiko Kusamura de Mattos                 Embrapa Roraima Boa Vista, RR 2010    Embrapa Roraima, Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento,  Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: Embrapa Roraima Rodovia BR-174, km 8 - Distrito Industrial Cx. Postal 133 –CEP. 69.301-970 Boa Vista- Roraima-Brasil Telefax: (95) 4009.7125 Home page: www.cpafrr.embrapa.br E-mail: sac@cpafrr.embrapa.br    Comitê de Publicações da Unidade  Presidente: Marcelo Francia Arco-Verde Secretário-Executivo: Everton Diel Souza Membros: Alexandre Matthiensen Antônio Carlos Centeno Cordeiro Carolina Volkmer de Castilho Edvan Alves Chagas Helio Tonini Kátia de Lima Nechet Paulo Sérgio Ribeiro de Mattos Normalização Bibliográfica: Jeana Garcia Beltrão Macieira  Editoração Eletrônica: Vera Lúcia Alvarenga Rosendo Revisão Gramatical: Ilda Maria Sobral de Almeida e Luiz Edwilson Frazão  1ª edição 1ª impressão (2010): 300 exemplares Dados Internacionais de Catalogação na Publicação – CIP Embrapa Roraima               Mattos, Paulo Sergio Ribeiro de.                      Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos                de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). Paulo Sergio               Ribeiro de Mattos e Keiko Kusamura de Mattos. - Boa                 Vista, RR: Embrapa Roraima, 2010.                      15p. (Boletim de Pesquisa e desenvolvimento / Embrapa               Roraima, 27).                         1. Eletroforese. 2. isozimas. I. Mattos, Keiko Kusama de. II. Título.                                                            CDD: 636.08                                                                   SUMÁRIO        Resumo........................................................................................................... 04 Introdução .......................................................................................................05 Referências Bibliográficas ............................................................................... 12                                                                Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus).  Paulo Sergio Ribeiro de Mattos 1    Keiko Kusamura de Mattos 2     RESUMO  O objetivo deste trabalho foi o de apresentar os padrões eletroforéticos de isozimas de lobos-guarás, indicando que esta metodologia pode ser utilizada também para outras espécies.  Foram estudados os padrões eletroforéticos de marcadores genéticos, dos seguintes sistemas proteicos: hemoglobina (Hb), haptoglobina (Hp), albumina, proteínas séricas inespecíficas (Ptn-x), fosfoglicose isomerase (Pgi), lactato desidrogenase (Ldh), superóxido dismutase (Sod), malato desidrogenase (Mdh), peptidase B (Pep-B), 6-fosfogluconato desidrogenase (Pgd), fosfatase ácida (PAc), anidrase carbônica II (AC II) e glioxalase (Glo).Os padrões eletroforéticos da Hb, Hp, Ptn 1-4, Pgi, Ldh e Sod, Mdh, Pep-B e Pgd.  Destes marcadores genéticos proteicos estudados (compreendendo 20 locos), apenas a fosfoglico-isomerase (Pgi), a peptidase B (Pep-B), a proteína inespecífica 4 (Ptn-4)e a glioxalase (Glo) apresentaram variação. Os estudos de marcadores proteicos podem apresentar uma grande rapidez na obtenção de resultados em laboratórios que já apresentam a rotina de estudar estes marcadores em outros animais. Isto se dá pelo fato de que as técnicas de coloração costumam detectar a atividade enzimática, que é semelhante entre as espécies, sendo bastante úteis para espécies silvestres, em que os marcadores nucleares e mitocondriais ainda não foram padronizados.  Palavras chave: Eletroforese, lobo-guará, isozimas.  1   Médico Veterinário , Pesquisador Embrapa Roraima 2   Médica Veterinária, pesquisadora da Fundação Estadual de Meio Ambiente, Ciência e Tecnologia do Estado de Roraima.  Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus).    5Introdução    O lobo-guará é considerado como uma espécie ameaçada de extinção pela lista oficial do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis – IBAMA, pelo decreto no 1210 de 12 de abril de 1939 e pela Portaria no 1511, de 22 de maio de 2003 (IBAMA, 2003), sendo classificado como vulnerável pela Internacional Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN, 1994). Estudos de genética de populações podem fornecer estimativas importantes para a conservação de carnívoros silvestres, como os valores de heterozigosidade, endogamia e estruturação populacional. As populações de animais ameaçados de extinção, que apresentam um tamanho reduzido, são mais sujeitas à deriva genética, que é a flutuação aleatória das frequências gênicas da população (BURNS, 1983). Uma maior ocorrência de cruzamentos de animais aparentados pode ocorrer em populações com pequeno número de indivíduos e em áreas com barreiras ao fluxo gênico. Estes cruzamentos consanguíneos podem levar a um aumento da ocorrência de características deletérias nas populações naturais (WOODROFFE; GINSBERG, 1998). Em lobos cinzentos (Canis Lupus) em cativeiro, submetidos a acasalamentos consanguíneos, foram detectadas ocorrências de cegueira, redução de peso de animais jovens, diminuição da longevidade e da eficiência reprodutiva (LAIKRE; RYMAN, 1991).  Como medida de preservação da diversidade alélica em populações naturais, Stockwell et al. (1996) discutem a utilização de translocamentos de animais. Os estudos genéticos de estruturação populacional podem contribuir para a avaliação do impacto que o isolamento populacional, por acidentes geográficos ou atividade antrópica podem estar criando nos padrões de migração e reprodução da espécie. A análise eletroforética de marcadores proteicos tem se mostrado como uma ferramenta útil para o conhecimento da genética de populações de lobos- guarás e outros canídeos silvestres (FERREL et al., 1980; KENNEDY et al., 1991; MOREIRA et al., 1998; MATTOS et al., 2008). O objetivo do trabalho foi o de disponibilizar os registros dos géis de eletroforese de isozimas de lobos guarás, para dar suporte aos estudos de genética de populações para a espécie, assim como para outras espécies filogeneticamente similares.  Procedimentos para o estudo Para obtenção de amostras, foram colocadas armadilhas de captura modificadas das descritas por Dietz (1984). O manejo dos animais capturados foi realizado através da Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 6  contenção anestésica, coleta de sangue, marcação por tatuagem e com coleiras comuns de cães domésticos. Os animais (n=28) foram capturados na Região Nordeste do estado de São Paulo e só foram liberados para retorno à natureza quando totalmente recuperados da exposição anestésica. A sedação foi realizada pela aplicação intramuscular de Tiletamina associada ao Zolazepam (Zoletil- laboratório Virbac), na dose de 7,0 mg/kg, através de um dardo medicamentoso projetado por zarabatana, conforme prescrito por Novaes (1997).  No laboratório as amostras de sangue heparinizado foram centrifugadas para a obtenção do plasma e o precipitado (papa de hemácias), foi lavado três vezes em solução de cloreto de sódio a 0,9% antes do congelamento (a –20°C). Após o descongelamento, as amostras foram misturadas em uma solução de mercaptoetanol 0,2% e centrifugadas. Papéis Whatman número 3 foram completamente embebidos com a solução, e após este procedimento, as amostras foram aplicadas nos géis, em cortes transversais, feitos previamente a uma distância de 5 cm da extremidade catódica. Estas amostras foram então submetidas a eletroforese sendo que a voltagem, tempo de corrida, tipos de géis e tampões utilizados estão indicados na tabela 1. Após a corrida, os géis foram submetidos à coloração específica, sendo que as proteínas com atividade peroxidásica (Hb e Hp) foram coradas com benzidina ou orto-dianisidina (SCHWANTES; TONDO, 1969; SCHWANTES, 1976), a albumina e as proteínas inespecíficas com o corante Coomassie blue e as enzimas segundo metodologias descritas em Harris e Hopkinson (1978). Assim foi realizado o estudo dos padrões de migração de cada sistema para as amostras obtidas. Com esta metodologia, foram estudados os seguintes sistemas proteicos: hemoglobina (Hb), haptoglobina (Hp), albumina, proteínas séricas inespecíficas (Ptn-x), fosfoglicose isomerase (Pgi), lactato desidrogenase (Ldh), superóxido dismutase (Sod), malato desidrogenase (Mdh), peptidase B (Pep-B), 6-fosfogluconato desidrogenase (Pgd), fosfatase ácida (PAc), anidrase carbônica II (AC II) e glioxalase (Glo).    Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 7  Tabela 1 – Condições eletroforéticas em que foram genotipados os sistemas proteicos de lobos-guarás. As siglas TC, TB, EBT e TEMM significam tris-citrato, tris-borato, tris - borato-EDTA e tris-EDTA anidrido maleico MgCl2 respectivamente. Os géis do tipo “A” são constituídos por amido hidrolisado de milho a 14%, do tipo “B” amido hidrolisado de milho a 2% e agarose a 0,8% e do tipo “C” de poliacrilamida a 10%.    Condições Ponte Gel Sistemas Volts Amperes Tempo  Tampão Tampão Tipo AcP e Mdh 220 50 5 horas TC pH 8,0 TC PH 8,0 Pep-B, ACII e Hp 160 30 5 horas Borato pH  8,3 TC pH  8,0 Pgi, Sod, Est-D, Pgd e Ldh 150 50 5 horas TC PH  6,6 Histidina pH  6,0 Hb 400 Variável 45 minutos EBT pH  8,9 EBT pH  8,9 A Glo 80 40 4 horas TEMM pH  7,4 TEMM pH  7,4 B Alb, Ptn 1-4 2500 70 2 horas TB pH  8,0 TC pH  8,7 C   Os padrões eletroforéticos da Hb, Hp, Ptn 1-4, Pgi, Ldh e Sod, Mdh, Pep-B e Pgd estão representados nas figuras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 respectivamente. Como os padrões eletroforéticos de lobo-guará não eram conhecidos, utilizou--se como controle, amostras com padrão de migração conhecida de outros mamíferos. A haptoglobina foi detectada como complexo hemoglobina de lobo-guará com haptoglobina humana por apresentar uma dissociação com a banda de hemoglobina humana, com uma resolução melhor do que quando utilizada a hemoglobina de lobo- guará (figura 1). Destes marcadores genéticos proteicos estudados (compreendendo 20 locos), apenas a fosfoglico-isomerase (Pgi), a peptidase B (Pep-B), a proteína inespecífica 4 (Ptn-4)e a glioxalase (Glo) apresentaram variação.   Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 8   +Origem  Figura 1- Eletroforese com coloração específica para hemoglogina. 1 – bovino, 2-16 – lobo- guará    Figura 2 - Eletroforese com coloração específica para proteínas com atividade peroxidásica, objetivando o estudo da haptoglobina. 1 – soro de lobo-guará, 2-16 – soro de lobo-guará e hemoglobina humana, 17 – soro humano, 18 – hemoglobina humana.             1     2    3     4     5   6    7   8    9   10  11  12  13   14  15  16 +Origem  1    2   3  4   5  6  7   8   9  10  11  12  13 14  15  16 17  18 +Origem  Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 9   Albumina  Figura 3 - Eletroforese de proteínas gerais do plasma. 1 e 31 equino, 2 a 30 lobo-guará  Figura 4- Eletroforese com coloração específica para fosfoglicoseisomerase (Pgi) em amostras de lobos-guarás   em Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3 Proteína 4             1  2   3   4  5  6 7  8  9 10  11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31     Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 10     Figura 5- Eletroforese com coloração específica para lactato desidrogenase (Ldh) de lobos- guarás, a superóxido dismutase (Sod) também pode ser visualizada.    Figura 6 - Eletroforese com coloração específica para malato desidrogenase (Mdh). 1- abelha, 2 a 19 lobo-guará. +Origem _     +Origem _  1    2   3   4  5   6   7   8   9  10   11  12  13  14  15   16  17    18   19  Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 11    Figura 7 - Eletroforese com coloração específica para peptidase B (Pep-B) de lobos-guarás.     Figura 8 - Eletroforese com coloração específica para 6 fosfogluconato desidrogenase (Pgd), a superóxido dismutase (Sod) também pode ser visualizada. 1 e 2 – abelha, 3 a 15 lobo-guará.  Estudos de genética de populações com marcadores nucleares e mitocondriais foram realizados em canídeos silvestres (WAYNE et al., 1991; GARCIA-MORENO et al., 1996; GIRMAN et al., 1993) e em outros carnívoros de vida livre (EIZIRIK et al., 1998;  EIZIRIK et al., 2001). Estes estudos indicaram que estes marcadores podem ser uma importante ferramenta de estudo de genética populacional do lobo- guará. Apesar de ser uma +Origem   +Origem -            1    2     3    4    5     6    7    8    9   10   11  12  13  14 15   Padrões Eletroforéticos de Marcadores Proteicos de Lobos-guarás (chrysocyon brachyurus). 12  metodologia mais antiga, os estudos de marcadores proteicos podem apresentar uma grande rapidez na obtenção de resultados em laboratórios que já apresentam a rotina de estudar estes marcadores em outros animais. Isto se dá pelo fato de que as técnicas de coloração costumam detectar a atividade enzimática, que é semelhante entre as espécies. Porém, os estudos de um maior número de marcadores se tornam limitados quando se tem apenas amostras de sangue, devido ao fato de que o metabolismo das células vermelhas é constituído primordialmente pela via glicolítica de Embden-Meyerhoff e do “shunt” alternativo da hexose monofosfato (BEUTLER, 1975), o que limita o estudo apenas às enzimas destas vias metabólicas. O plasma e as células brancas apresentam um número limitado de componentes protéicos com concentrações compatíveis para o estudo eletroforético. Níveis de variabilidade genética mensurada através de marcadores protéicos foram realizados em lobos-guarás por Moreira et al. (1998) e Mattos (2008). Estes estudos e apontam para a importância do estudo de marcadores genéticos, como ferramenta útil no diagnóstico da diminuição de variabilidade genética em populações isoladas de canídeos silvestres ameaçados de extinção.     REFERÊNCIAS BEUTLER, E. Red cell metabolism: a manual of biochemical metods. New York : Ed. Grune & Stratton, 1975. 160p. BURNS, G. V.  Genética: uma introdução à hereditariedade. 4.ed. Rio de Janeiro: GUANABARA KOOGAN, 1983. 558p.  DIETZ, J. M. Ecology and social organization of the maned wolf (Chrysocyon brachyurus). Smithsonian Contributions Ecology, v. 392, p.1-24, 1984. EIZIRIK E.  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