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COSTA, M. R.

LAMEIRA, O. A.

SOUSA, C. do S. M. de

Infoteca-e

ISSN 1517-2252.....-a.~~;mstérooda Agnculturae do AbastecimentoPESQUISAEMANDAMENTOAmazônia OrientalMinistério da Agricultura e do AbastecimentoTrav. Dr. Enéas Pinheiro s/n, Caixa Posta/48.Fax (91) 276-9845, Fone: (91) 276-6333,CEP 66.017-970 e-meit: cpatu@cpatu.embrapa.brPesqui. andam. N~9, Dezembro/99, p.1-3DEFINiÇÃO DE PROTOCOLO PARA ELETROFORESE DEISOENZIMAS DE IPECACUANHA (Psychotria ipecacuanhaStokes) EM GEL DE POLIACRILAMIDAMaria Rosa Costa 1Osmar Alves l.arneira?Claud'ne do Socorro Mendes de Sousa"A Ipecacuanha (Psychotria ipecacuanha Stokes) é uma planta medicinalda família Rubiaceae, conhecida vulgarmente por ipeca, sendo indicada no trata-mento antidiarréico, amebicida, expectorante e antiinflamatório, tendo como princí-pio ativo a emetina.Uma coleção desta espécie, com 72 acessos, está sendo mantida noCampo Experimental da Embrapa Amazônia Oriental, visando assegurar fontes degenes para utilização futura em programas de melhoramento genético e outras áre-as afins, que são fundamentais para o desenvolvimento sustentável da agricultura eo sucesso da produção agrícola, além de prevenir a perda de valiosos recursosgenéticos.A caracterização molecular através das diversas técnicas de marcadoresmoleculares, hoje amplamente divulgadas, pode enriquecer e direcionar as informa-ções no processo de conhecimento do germoplasma disponível, essencial para suautilização em etapas subseqüentes de programas de melhoramento genético deplantas. A conservação dos recursos genéticos disponíveis depende, fundamental-mente, do conhecimento e da quantificação da variabilidade genética que ocorrenas espécies.Uma das maneiras de se caracterizar germoplasma é através da eletrofo-rese de isoenzimas. Os marcadores bioquímicos, como as isoenzimas, examinadaspor eletroforese, são mais sensíveis para estimar a variabilidade genética do que ascaracterísticas morfológicas, tendo em vista que sofrem menor influência ambiental(Pimentel, 1988). Segundo Cheliak & Pitei (1984), os marcadores isoenzimáticosnormalmente não afetam as características fenotípicas adaptativas, ou seja, são'Eng.-Agr., M.Sc., Pesquisador da Embrapa Amazônia Oriental, Caixa Postal 48, CEP 66017-970,Belém, PA.'Eng.-Agr., Dr., Pesquisador da Embrapa Amazônia Oriental.3 ..... .•., ...------------------- PESQUISA EM ANDAMENTOmarcadores neutros que não estão sujeitos à seleção natural. Por isso, permitem aformulação de hipóteses relativas à quantidade, distribuição e manutenção da vari-abilidade genética em populações naturais ou artificiais.A eletroforese é considerada uma técnica versátil para a análise de pro-teínas, sendo de fácil aplicação em estudos que abordam a variação genética pre-sente nos organismos. Essa técnica, desenvolvida inicialmente por Kunkel eTeselius, no ano de 195'1, e, mais tarde, aperfeiçoada com a introdução de umacamada suporte, de amido (Smithies, 1955), e de poliacrilamida (Ornstein & Davis,1962, citados por Steward et aI. (1965), consiste basicamente na migração dife-rencial de proteínas em campo elétrico, onde a velocidade de deslocamento dasmoléculas depende da carga elétrica líquida de sua superfície externa, seu tamanho,forma e a porosidade do meio suporte utilizado. Como isoenzimas são formas alter-nativas de uma molécula, pequenas mudanças na estrutura da proteína são detec-tadas por essa técnica (Hames, 1966).Este trabalho está sendo desenvolvido no Laboratório de Recursos Gené-ticos e Biotecnologia (seção de genética) da Embrapa Amazônia Oriental, com oobjetivo de definir protocolo para eletroforese de isoenzimas de ipeca, identifican-do-se padrões enzimáticos com boa resolução, que permitam visualizar locus e ale-los que possam ser utilizados como marcadores genéticos na caracterização genéti-ca de acessos de ipeca.A extração de isoenzimas foi feita a partir de folhas jovens, coletadas noBanco de Germoplasma de Ipeca, que foram acondicionadas em sacos de plásticonumerados, e colocadas em isopor com gelo para manter a temperatura baixa e evi-tar a desnaturação de enzimas. O extrato foi obtido triturando-se manualmente cer-ca de 50mg de tecido foliar, em almofariz e pistilo, com 1ml de tampão de extraçãoe 70mg de pvpp (polivinilpolipirrolidona), sob nitrogênio líquido. Os extratos foramtransferidos para os tubos de Eppendorf (1,5 ml), que foram submetidos à centrifu-gação (40 minutos em rotação de 15.000rpm a 4°C), para separação do extratoenzimático do precipitado vegetal. As amostras foram aplicadas nas canaletas dogel de poliacrilamida, e o aparato vertical (de duas placas) foi submetido à corridaeletroforética, sob condições de 16 a 30mA e 100 a ',150 V, à temperatura de 4°C.Após a eletroforese, os géis foram removidos das placas e incubados em soluçõesespecíficas, contendo os substratos, coenzimas, soluções-tampão e sais necessári-os para a revelação das bandas. Os tampões de gel-eletrodo e de coloração utiliza-dos foram os descritos por Tsumura et aI. 1990, modificados.Foram testados os seguintes sistemas enzimáticos na ipeca: Diaforase(DIA), Malato Desidrogenase (MDH), Enzima Málica (ME), Glutamato OxaloacetatoTransaminase (GOT), Xiquimato Desidrogenase (SKDH), 6-fosfogluconato Desidro-genase (6PGDH), Glucose 6-fosfato Desidrogenase (G6PDH), Leucina Aminopepti-dase (LAP), Glutamato Desidrogenase (GTDH), Tetrazólio Oxidase (TZO), Menadio-na Redutase (MR), Sorbitol Desidrogenase (SDH), Fumarase (FUM), Aconitase(ACO), Fosfogluco Isomerase (PGI), Fosfatase Ácida (ACP), Fosfoglucomutase(PGM) e Aldolase (ALD).Os resultados preliminares obtidos indicam que dos 18 sistemas investi-gados, dez apresentaram zimogramas de boa resolução (GOT, ACP, MNR, DIA,FUM, PGI, ADH, MDH, ME e GDH). Quanto ao restante, os sistemas SKDH, PGM,ACO e LAP não mostraram atividade em folhas de Ipeca, com o extrator testado.r------------------ PESQUISA EM ANDAMENTONos sistemas 6PGDH, SoDH, G6PDH e TZO, a resolução não foi satisfatória, ouseja, houve atividade, porém, formaram-se manchas difusas no gel, dificultando avisualização das bandas. Nestes sistemas estão sendo feitos ajustes no protocolode extração e/ou coloração. Os sistemas GOT, ACP, MNR, DIA, FUM, PGI, ADH,MDH, ME e GDH, que apresentaram polimorfismo, serão utilizados como marcado-res. na caracterização molecular desta espécie, que será a etapa subsequente destetrabalho.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASCHELlACK, W.M.; PITEL, J.A. Electrophoretic identification of clones in tremblingaspen. Canadian Journal of Forest Research. v.14, p.740-743, 1984.HAMES, D.B. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In: HAMES,.0.8.; RICKWOOD, D., ed. Gel electrophoresis of proteins: a pratica I approach.2. ed. New York: Oxiford University Press, 1966. 139p.PIMENTEL, A.M. Utilização da técnica da eletroforese em genética florestal.Piracicaba: IPEF, 1988. 27p. (IPEF.Técnica, v.5, n.15).STEWARD, F.C.; LYNDON, R.F.; BABER, J.T. Acrylamide gel electroforesis ofsoluble plant proteins: a study on pea seedlings in relation to development.American Journal of Botany. v.52, n.2, p.155-164, 1965.TSUMURA, Y.; TOMARU, N.; SUYAMA, Y.; NAIM, M.; OHBA, K. Método de aná-lise de isoenzimas. In: TSUKUBA. Universidade. VI relatório sobre treinamentode estudos florestais. Tsukuba, 1990. p.63-95 texto em Japonês.

Definição de protocolo para eletroforese de isoenzimas de Ipecacuanha (Psychotria ipecacuanha Stokes) em gel de poliacrilamida.

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