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ALBUQUERQUE, F. C. de

ITO, T.

NASCIMENTO R. M. do

STEIN, R. L. B.

Portuguese

Infoteca-e

ISSN 0100-8102Novembro, 1996Producão Artificial"de Basidiocarpos deCrinipellis perniciosa doCupuaçuzeiro em meio deFarelo- VermiculitaEm",. •• ., ••0.". d. "'.qul •• Agro".culri.eM"" d. "'.qul •• Agrofio,..t.1 d. Am.z(Jnl. Ori.nt.1Ministl,io da Ag,icultu,a e do AbastecimentoREPÚBLICA FEDERATIVA DO BRASILPresidente da RepúblicaFernando Henrique CardosoMINISTÉRIO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTOMinistroArlindo Porto NetoEMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIAPresidenteAlberto Duque PortugalDiretoresDante Daniel Giacomelli ScolariElza Angela Battaggia Brito da CunhaJosé Roberto Hodrigues PeresChefia do CPATUEmanuel Adilson Souza Serrão - Chefe GeralJorge Alberto Gazel Yared - Chefe Adjunto de Pesquisa e DesenvolvimentoAntonio Carlos Paula Neves da Rocha - Chefe Adjunto de Apoio TécnicoAntonio Ronaldo Teixeira Jatene - Chefe Adjunto AdministrativoBOLETIM DE PESQUISA Na 167 ISSN 0100-8102Novembro, 1996Producão ArtificialIde Basidiocarpos deCrinipellis perniciosa doCupuaçuzeiro em meio deFarelo- VermiculitaRuth Linda Benchimol SteinTsutae ItoFernando Carneiro de AlbuquerqueRisaldo Muniz do NascimentoBelém, PA1996Exemplares desta publicação podem ser solicitados à:Embrapa-CPA TUTrav. Dr. Enéas Pinheiro, s/nTelefones: (091) 246-6653, 246-6333Telex: (91) 1210Fax: (091) 226-9845Caixa Postal, 4866095-100 - Belém, PATiragem: 300 exemplaresComitê de PublicaçõesAntonio Ronaldo Camacho Baena - PresidenteAri Pinheiro CamarãoCélia Maria Lopes PereiraIsmael de Jesus Matos ViégasJorge Alberto Gazel YaredMaria de Lourdes Reis DuarteMaria de Nazaré Magalhães dos Santos - Secretária ExecutivaMoacyr Bernardino Dias FilhoNoemi Vianna Martins Leão - Vice-PresidenteRaimundo Nonato Brabo AlvesSérgio de Mello AlvesRevisores TécnicosMaria de Lourdes Reis Duarte - Embrapa-CPA TUSérgio Eduardo Abud Fonseca - CEPLACExpedienteCoordenação Editorial: Antonio Ronaldo Camacho BaenaNormalização: Célia Maria Lopes PereiraRevisão Gramatical: Maria de Nazaré Magalhães dos SantosMoacyr Bernardino Dias Filho ttex to em inglês)Composição: Euclides Pereira dos Santos FilhoCDD: 589.22STEIN, R.L.B.; ITO, T.; ALBUOUEROUE, F.C. de; NASCIMENTO, R.M. do. Pro-dução artificial de basidiocarpos de CrinlpEll/s pErnlclosiI do cupuaçuzeiroem meio de farelo-vermiculita. Belém: Embrapa-CPA TU, 1996. 15p.(Embrapa-CPA TU. Boletim de Pesquisa, 167).1. Cupuaçu - Doenças - Fungo. 2. Fungo - Meio de cultura. 3. Crinipe/lisperniciosa. I. tto, T., colab. 11. Albuquerque, F.C. de, colab. 111.Nascimento,R.M. do, colab. IV. Embrapa. Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amaz6niaOriental (Belém, PA). V. Título. VI. Série.@ Embrapa - 1996SUMÁ RIOINTRODUÇÃO 6MA TERIAL E MÉTODOS 8RESUL TADOS E DiSCUSSÃO 9CONCLUSÃO 13REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFiCAS 13PRODUÇÃO ARTIFICIAL DE BASIDIOCARPOS DECrinipellis perniciosa DO CUPUA ÇUZEIRO EM MEIODE FARELO-VERMICULITARuth Linda Benchimol Stein'Tsutae It02Fernando Carneiro de Albuquerque'Risaldo Muniz do Nescimento"RESUMO: A produção artificial de besidiocerpos pelo isoladoC990 de Crln/~III. ~rnlclo.~ do cupuaçuzeiro foi obtidaapós a colonização, durante oito semanas, pela fase seprott-tica do patógeno em um meio de cultura artificial à base defarelo-vermicu/ita (50 g de farelo de trigo; 40 g de vermiculi-ta; 6 g de CaS04. 2H20; 1,5 g CaC03; 120 ml de águadestilada; pH 7,0-7,5) e posterior transferência para um te-lado com 50% de sombreamento e irrigação controlada, comciclos diários de 6 horas de molhamento e 18 horas de seca,objetivando induzir à produção de basidiocarpos. Após asprimeiras quatro semanas de incubação em laboratório, foiacrescentada sobre as culturas uma fina camada (5-10g) àbase de musgo desidratado (200g de musgo desidratado;50g de CaC03; 50g de vermicu/ita; 125ml de água destila-da). A produção de basidiocarpos pelo isolado C990 de C.perniciosa do cupuaçuzeiro teve início após dez semanas depermanencia no telado e foi observada por um período de 38dias. A patogenicidade dos basidiocarpos produzidos artifi-cialmente foi comprovada através de inoculações em mudasde cupuaçuzeiro.Termos para indexação: Crinipellis perniciosa, basidiocar-pos, Theobrom~ gr~ndiflorum, produção artificial.1 Eng.- Agr., M.Sc., Embrapa-CPATU, Cx. Postal 48, CEP 66017-970, Belém-PA.2 Consultor Convênio Embrapa-CPA TU/JICA.3 Bolsista CNPq/Embrapa-CPA TU.ARTIFICIAL BASIDIOCARP PRODUCTlON OF THE"CUPUAÇU" TREE PA THOGEN Crinipellis perniciosaUSING A BRAN- VERMICULlTE MEDIUMABSTRACT: Basidiocarps artificial production by the isola teC990 of "cupueçu" tree pathogen CrlnlpEllis pErniciosa,the witches' broom disease eçent, was achieved after aeight-week colonization by the saprophitic phase of thefungus on a bran-vermiculite medium (50g wheat bran; 40gvermiculite; 6g CaS04. 2H20; 1,5g CaC03; 120ml distilledwater; pH 7,0-7,5) in laboratory conditions and subsequentremove to a cabinet with 50% of shade and controlled dailycycle of 6 hours of wetting and 18 hours of drying, in orderto induce basidiocarp production. After the first four weeksof incubation in the laboratory, the application of a 5-10gpeat moss based case (200g peat moss; 50g CaC03; 50gvermiculite; 125ml distilled water) was put on the incubatedcultures. The fruitification of the isola te C990 began after10 weeks in the cabinet and lasted for 38 days. Thepathogenicity of the artificially produced basidiocarps wasconfirmed through inoculations on "cupueçu" seedlings.Index terms: Crinipellis PErmclosil, basidiocarps,ThEobromil grilndiflorum, artificial productionI/VTRODUÇÃ Oo cupuaçuzeifo (ThEobror.na grandiflorur.nSchum.) é uma fruteira tropical com grande potencial eco-nômico, cujas áreas de plantio racional estão em franca ex-pansão na Amazônia (Calzavara et aI. 1984; Müller etaI. 1995). Este fato favorece o aumento da incidência daprincipal doença que ataca essa cultura na região, a vassou-ra-de-bruxa (CrinipEllispErniciosa (Stetiet) Singer).O agente causal da vassoura-de-bruxa é um besi-diomiceto da família Agaricaceae, cujos propágulos infectivossão representados unicamente por basidiosporos (Evans,1980). Esses propágulos, liberados por corpos frutíferos dopatógeno denominados basidiocarpos, são produzidos apenas6em determinadas épocas do ano (Rocha & Wheeler, 1985), oque dificulta a condução de trabalhos de pesquisa sobre abiologia, epidemiologia e controle de C PErniciosa. Para queesses estudos tenham continuidade, há necessidade de umsuprimento constante desses propágulos infectivos.Diversos trabalhos têm sido conduzidos a fim deproduzir basidiocarpos em condições artificiais, mais especi-ficamente do isolamento de C perniciosa que intecte o ca-caueiro. Diferentes métodos têm sido utilizados, como: micé-tio do fungo em potes de porcelana pendurados sob árvores(Stahel, 1919); vassouras penduradas em "cebinets" comcontrole de umidade e temperatura (Suarez, 1977; Rocha &Wheeler, 1982, 1985); micélio do patógeno cultivado essep-ticamente e inoculado em vassouras esterilizadas (Purdy etaI. 1983; Purdy & Dickstein, 1990); micélio inoculado emvassouras esterilizadas embebidas em agar-água (Merchan,1979; Purdy et aI. 1983; Pickering & Hedger, 1987); micélioformando estromes semelhantes a calos em meio de cultura(Bastos & Andebrhan, 1987); e micélio inoculado em meio detereto-vermiculite. mantido em condições utilizadas conven-cionalmente para a produção de cogumelos (Elliot, 1985;Griffith & Hedger, 1993).O objetivo deste trabalho foi testar, no isolamentoC990 de C pErniciosa do cupuaçuzeiro, a metodologia deprodução artificial de basidiocarpos de CrinipEllis pErniciosaproposta por Griffith & Hedger (1993) para isolamentos docacaueiro.7MA TER/AL E MÉTODOSPara a produção artificial de basidiocarpos deC perniciosa do cupuaçuzeiro na ausência desse hospedeiro,foi testada a metodologia proposta por Griffith & Hedger(1993), com modificações no período de molhamento e nocontrole de temperatura e umidade. Foi utilizado o meio defarelo-vermiculita, em cujo preparo misturou-se 50g de farelode trigo, 40g de vermiculita; 6 g de CaS04 2H20; 1,5g deCaC03; e 120ml de água destilada (pH 7,0-7,5). Após a no-mogeneização, o meio foi distribuído em cinco bandejas des-cartáveis de alumínio (15 x 10 x 5 em), na proporção de 25 a30g de meio de cultura/bandeja, e autoclavado (20 minutos;15 psil. Após o resfriamento, cada bandeja foi inocutede comdois discos equidistantes de micélio (0 = 5mm) retiradoscom vazador-de-rolha da extremidade de col6nias de um iso-lamento de C perniciosa do cupuaçuzeiro (C990), obtido emCastanhal, A, e cultivado por 15 dias em meio de cultura deextrato de malte-agar (Extrato de malte 3g; Extrato de leve-dura 2g; KH2P040,5g; MgS04 0,5g; Agar 20g; Agua destila-da 1.000 mt)Após quatro semanas de incubação no laboratório,as bandejas foram abertas em condições assépticas e as cul-turas recobertas com uma fina camada (5 a 10g por cultura)de substrato previamente autoclavado, composto de 200g demusgo desidratado, 50g de CaC03, 50g de vermiculita e125ml de água destilada, permanecendo incubadas por maisquatro semanas. Após esse período, as bandejas foram no-vamente abertas, as culturas tiveram a sua camada superiorescarificada e foram imediatamente transferidas para umacasa-de-plástico (2 x 2 x 3m), envolvida por sombrite (50%),com sistema artificial de irrigação por aspersão regulado parafuncionar durante seis horas/dia, no intervalo entre 16:00 e22:00 h, proporcionando uma precipitação artificial de121mm/dia, medida através de pluvi6metro instalado no lo-cal. Um termohigrógrafo registrou as médias de temperatura8e umidade relativa no interior da casa-de-plástico durante operíodo do experimento, que foram de 27,1 DCe 85 %, res-pectivamente. Essas condições foram modificadas em rela-ção à metodologia original proposta por Griffith & Hedger(1993), onde o período de molhamento foi de sete horas diá-rias, nos intervalos de 2:00 às 8:00h e 16:00 às 17:00h, aluminosidade foi artificial (8:00 às 20:00h; lâmpadas fluores-centes brancas de 65-80W) e a temperatura foi mantida a27°C.RESULTADOS E DISCUSSÃOA produção de basidiocarpos pelas culturas artifi-ciais do isolamento C990 de C pErniciosa (Fig. 1) foi inicia-da 70 dias após ser transferida do laboratório para o telado.Nos primeiros 13 dias, foram produzidos de oito a 19 basidi-ocarpos/dia, a intervalos de dois a cinco dias. Nas duas se-manas seguintes, houve uma redução na produção para amédia de um basidiocarpo a cada seis dias e subseqüenteaumento para a média de dez basidiocarpos a cada 6- 7 dias(Tabela 1). Após cada contagem, os basidiocarpos foramremovidos e conduzidos ao laboratório, para indução à libera-ção de basidiosporos, os quais foram usados em testes depatogenicidade em mudas de cupuaçuzeiro.Os resultados observados são semelhantes àque-les obtidos por Griffith & Hedger (1993), onde a produção debasidiocarpos se verificou após um período variável de incu-bação entre dez e 16 semanas. O período produtivo das cul-turas dentro das condições referidas anteriormente durou 38dias, após o que não foi mais observada a emissão de basidi-ocarpos.Os basidiocarpos produzidos artificialmente apre-sentaram cor e tamanho semelhantes aos produzidos natu-ralmente. Os testes de patogenicidade de basidiosporosliberados por basidiocarpos produzidos artificialmente e inocu-lados em mudas de cupuaçuzeiro com seis meses de idadeforam positivos.Tabela 1. Produção de basidiocarpos pelo isolado C990 deC PErniciosa do cupuaçuzeiro em meio de farelo--vermiculitaDias após a transferênciadas culturas para o tela do~ médio debasidiocarpos70 1172 1275 0877 1382 1990 0295 01101 11108 10115 O122 O129 O143 O157 O1011Estudos sobre a produção natural de basidiocarposde C perniciosa do cupuaçuzeiro em vassouras destacadas,realizados sob telado, em Belém, PA, demonstraram que aprodução dessas estruturas reprodutivas foi mínima ou ine-xis tente nos períodos de janeiro-abril e agosto-dezembro,aumentando progressivamente a partir de maio, com pico emjulho (Stein, 1994; Stein et aI. 1996). No entanto, usando-seuma metodologia de produção artificial que permite a manu-tenção de condições nutricionais e de umidade para o petô-geno durante qualquer época do ano, foi possível a produçãodessas estruturas reprodutivas no período de outubro-dezembro (Fig. 2).6050••a 40:-g'6 30Ou;ta...••'ti 20oz10oOutubro Novembro Dezembro JaneiroMêsFIGo20 Produção mensal de basidiocarpos pelo isolamentoC990 de C perniciose do cupuaçuzeiro em meio arti-ficial de farelo-vermiculita.12CONCLUSÃOA metodologia de produção artificial de besidio-carpos de C pErniciosa do cacaueiro, proposta por Griffith &Hedger (1993), com modificações no período de molhamentodas vassouras e no controle de temperatura e umidade, foiaplicada com sucesso para o isolamento C990 de C PErnici-osa do cupuaçuzeiro, podendo ser utilizada para a obtençãode inóculo sem a presença do hospedeiro, em épocas do anoonde não se verifica a produção natural de basidiocarpos dopatógeno.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBASTOS, C.N.; ANDEBRHAN, T. In vitro production ofbasidiospores of CrinipEllis pErniciosa (Stenet) Sing.,the causative agent of witches' broom disease of cocoa(Theobroma cacao L.). Transaction 01 British MycologicalSociety, v. 88, p. 404-409, 1987.CALZAVARA, B.B.G.; MÜLLER; C.H.; KAWAGE, O.N.C.Fruticultura tropical: o cupuaçuzeiro: cultivo, beneficia-mento e utilização do fruto. Belém: Embrapa-CPATU,1984. 10 1p. ilust. (Embrapa-CPATU. Documentos, 32).ELLlOT, T.J. Spawn-making and spawns. In: FLEGG, P.B.;SPENCER, D.M.; WOOD, D.A. eds. The biology andtechnology 01 the cultivated mushrooms. London: JohnWilley and sons, 1985. p. 131-140.EVANS, H.C. Pleomorphism in CrinipEllis pErniciosa, causalagent of witches' broom disease of cocoa. Transaction01 British Mycological Society, v. 74, p.515-523, 1980.13GRIFFITH, G. W.; HEDGER, J.N. A novel method forproducing basidiocarps of the cocoa pathogen CrinipEllispErniciosa using a bran-vermiculite medium. 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Produção artificial de basidiocarpos de Crinipellis perniciosa do cupuaçuzeiro em meio de farelo-vermiculita.

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