ANDRIOLI, A.

ARAGÃO, M. A. do C.

DIAS, R. P.

PINHEIRO, R. R.

TEIXEIRA, M. de F. da S.

Portuguese

A Maedi-Visna é uma enfermidade viral economicamente importante de ovinos que ocasionalmente afeta caprinos. O vírus Maedi-Visna, um lentivírus, infecta seus hospedeiros por toda a vida. Embora uma parte dos animais infectados apresente-se como subclínicos, outros desenvolvem síndromes intratáveis incluindo dispnéia (Maedi) ou sinais neurológicos (Visna). Ambas, Maedi e Visna são efetivamente fatais. As perdas econômicas incluem restrições de exportação, desvalorização do rebanho, abate prematuro, redução da produção de leite por mastite endurativa, dentre outras. Estas perdas podem variar consideravelmente entre os rebanhos. O Dot-Blot (DB) ou Dot-ELISA é um teste já desenvolvido para diagnosticar patologias virais como reovírus aviário HIV, bem como a Artrite Encefalite Caprina

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Método do Dot-Elisa paraDiagnóstico da Maedi-VisnaIntroduçãoA Maedi-Visna é uma enfermidade viral economica-mente importante de ovinos que ocasionalmente afetacaprinos. O vírus Maedi-Visna, um lentivírus, infectaseus hospedeiros por toda a vida. Embora uma partedos animais infectados apresente-se como sub-clínicos, outros desenvolvem síndromes intratáveisincluindo dispnéia (Maedi) ou sinais neurológicos(Visna). Ambas, Maedi e Visna são efetivamentefatais. As perdas econômicas incluem restrições deexportação, desvalorização do rebanho, abate prema-turo, redução da produção de leite por mastiteendurativa, dentre outras. Estas perdas podem variarconsideravelmente entre os rebanhos.O Dot-Blot (DB) ou Dot-ELISA é um teste já desenvol-vido para diagnosticar patologias virais como reovírusaviário (GEORGIEVA et al., 2002), HIV (HERBELLINGet al., 1988), bem como a Artrite Encefalite Caprina(PINHEIRO, 2001; PINHEIRO et al., 2006), no entanto,Raymundo Rizaldo Pinheiro1Maria Alzira do Carmo Aragão2Maria de Fátima da Silva Teixeira3Alice Andrioli1Ronaldo Pereira Dias4123ISSN 1676-7675Sobral, CeNovembro, 2011Técnico1 Med. Vet., D. Sc., Pesquisador Embrapa Caprinos e Ovinos, Fazenda Três Lagoas, Estrada Sobral/ Groaíras, Km 04, Caixa Postal 145,CEP- 62010-970, Sobral/CE. E-mail: rizaldo@cnpc.embrapa.br2 Bióloga, M. Sc.3 Med. Vet., D. Sc., Universidade Estadual do Ceará4 Zootecn., M. Sc.ComunicadoOn lineMetodologia Científicanão se encontraram, na literatura, registros da utiliza-ção desta técnica para diagnóstico da Maedi-Visna.Em virtude da alta sensibilidade, especificidade e umcusto baixo (PINHEIRO et al., 2006a), observou-setestá-lo para Maedi Visna.A técnica baseia-se na sensibilização de membranasde nitrocelulose com Antígeno (Ag) e posterior adiçãode um Anticorpo (Ac) marcado com peroxidase, paraocorrência de reação e revelação com formação decor. O princípio é semelhante ao ELISA, no entanto, nãorequer aparelhagem sofisticada (PINHEIRO, 2001;PINHEIRO et al., 2006). Apresenta, ainda, uma sensibi-lidade superior a IDGA e uma praticidade que o torna,neste termo, mais vantajoso que o ELISA. Quandocomparado ao Western Blotting (WB), que é um testede alta confiabilidade para diagnóstico das lentivirosesde pequenos ruminantes (LVPR), em termosmetodológicos, torna-se mais simples visto que nãorequer a realização da eletroforese. Os resultados sãoverificados através de manchas (dots), forma seme-lhante à observação dos resultados do WB.2 Método do Dot-Elisa...Na padronização do DB descrito a seguir foramutilizadas 246 amostras de soro ovino coletadas porvenipuntura da jugular provenientes de rebanhos dointerior do Ceará, os quais foram testados previamen-te pela Micro Imunodifusão em Gel de Agarose(MIDGA), utilizando-se o kit comercial CaprineArthritis-Encephalitis/Ovine Progressive PneumoniaAntibody Test Kit. Veterinary Diagnostic Technology,IncÒ, USA.Protocolo do Dot-ELISAO antígeno para o teste foi produzido com cepa padrão(K1514) cultivado em células de membrana sinovialovina de acordo com a metodologia descrita porPinheiro et al. (2006).A dosagem de proteínas do antígeno mostrou umaconcentração de 2,5 µg/µL. A partir deste valor,realizou-se uma titulação do antígeno como forma deverificar a menor concentração capaz de promover areação. Membranas de nitrocelulose foram colocadasno aparelho de Dot e sensibilizadas com antígenodiluído em PBS (Na2HPO4 0,5 M; NaH2PO4  0,5 M;NaCl; pH 7,4) nas concentrações de 0,25; 0,5; 1,0 e 2µg/ poço e secas durante dez minutos com jato de arquente. Cada concentração foi feita em quadruplicatacom duas réplicas para cada concentração. Apósdevidamente secas, foram, então, coradas comcorante Ponceau e numeradas. A partir desta etapaforam divididas em dois grupos e submetidas a doistipos de bloqueio. Grupo A, bloqueado com TTBS (Tris20 mM; NaCl 500 mM, Tween 20 0,05 %, pH7,5)(GEORGIEVA et al., 2002) por 15 minutos e grupo Bbloqueado com PBS-Tween 0,3 % por 40 minutos.Passados os respectivos tempos, as membranasforam lavadas duas vezes por dois minutos sobagitação lenta com PBS-Tween 0,05 % e submetidasa duas diluições distintas (1:25 e 1:50) do soropositivo e soro negativo (ambos do kit comercial)durante 30 minutos. Numa etapa seguinte, as mem-branas foram novamente lavadas e incubadas comconjugado em duas diluições (1:10000 e 1:15000)durante 30 minutos. Passado este período, as mem-branas foram lavadas duas vezes com PBS-Tween0,05 %, duas com PBS e reveladas com 4 cloronaftole diaminobenzidina (DAB). A reação ocorreu em umminuto e a reação foi parada com água destilada.Considerou-se como melhor resultado para efeito dapadronização, a maior diluição do antígeno que apre-sentou melhor diferenciação visual de cor entre o soropositivo e o negativo. A partir deste resultado inicial,realizou-se um novo teste, no qual se avaliou o desem-penho do fraco positivo (do kit americano), testando-se, ainda, as diluições de conjugado 1:10000,1:15000 e 1:20000. Todas as etapas foram realiza-das em estufa a 37°C sob agitação constante.Para o antígeno, todas as concentrações testadasreagiram especificamente com as diluições do soroutilizadas, revelando a possibilidade de utilização dequalquer título estudado para uso eficiente na execu-ção dos testes. Entretanto, a concentração ótimaconsiderada para efeito de padronização foi a de 0,25ug/ poço de proteína viral. A melhor diluição do conju-gado foi de 1:15000, a qual apresentou melhordistinção visual entre os soros controles positivos enegativos. Ambos os bloqueios tiveram o mesmodesempenho, sendo o bloqueio com TTBS o preferidoem virtude de requerer, apenas 15 minutos de ação.O valor de diluição ótima dos soros empregados narealização dos testes foi de 1:50, entretanto, o Dot foicapaz de detectar as variadas diluições utilizadas(1:25; 1:50) (Fig. 1).Fig. 1. Resultado das padronizações realizadas. Na vertical encontram-se asdiluições de antígeno. Na horizontal encontram-se as diluições do soro,onde A= 1:50+; B= 1: 50-; C= 1: 25+; D= 1:25-. Bloqueio utilizado:TTBS. A área marcada corresponde a diluição ótima de antígeno e soro.Durante a análise dos 246 testes, foi possível verifi-car uma distinção precisa entre os soros positivos enegativos. Devido à utilização de controles positivos enegativos, o poço considerado positivo foi o quevisualmente mais se distinguiu do padrão negativo.Estes resultados demosntraram a eficiência do testeno diagnóstico da Maedi-Visna.Embora não haja dados documentais acerca da distribui-ção do vírus da Maedi-Visna (MVV) no Brasil, comoocorre no caso do vírus da Artrite-Encefalite Caprina, éimportante considerar a ocorrência deste vírus no país.A própria constatação da possibilidade de ocorrência datransmissão entre espécies por si só, já suscita umaatenção maior pelo fato de abrir precedente para a3Método do Dot-Elisa...Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Caprinos e OvinosEndereço: Estrada Sobral/Groaíras, Km 04 - CaixaPostal 145 - CEP: 62010-970 - Sobral-CEFone: (0xx88) 3112-7400Fax: (0xx88) 3112-7455Home page: www.cnpc.embrapa.brSAC:  http://www.cnpc.embrapa.br/?pg=sac1a ediçãoOn line (Nov/2011)Presidente: Marco Aurélio Deolmondes BomfimSecretário-Executivo: Alexandre César Silva MarinhoMembros: Carlos José Mendes Vasconcelos, Tânia MariaChaves Campelo, Luciana Cristine Vasques Villela,Antônio Cézar Rocha Cavalcante, Sérgio Cobel da Silva,Adriana Brandão Nascimento Machado, Manoel EverardoPereira Mendes e Geny Rodrigues Cunha de Queiroz(suplente)Supervisão editorial: Alexandre César Silva Marinho.Revisão de texto: Carlos José Mendes Vasconcelos.Normalização bibliográfica: Tânia Maria Chaves Campelo.Editoração eletrônica: Comitê Local de PublicaçõesComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico,123On lineexistência de um diagnóstico cruzado, na medida emque caprinos que poderiam estar sendo diagnosticadoscomo positivos para CAEV, seriam, na verdadepositivos para MVV. O Brasil, ainda se encontra noinício da implantação de normas sanitárias internasacerca das lentiviroses. O desenvolvimento de testesmais específicos aos respectivos vírus, bem como autilização de diagnósticos mais rápidos e precisos, faz-se necessário. Suplantar a atual realidadeepidemiológica da transmissão poderá em longo prazo,impulsionar a ocorrência de mutações formando cepasvirais distintas e mais potentes no que diz respeito aburlar os testes diagnósticos atualmente disponíveis.ReferênciasGEORGIEVA, M.; POPOV, G.; PLOCHEV, K. A. Dot-immunobinding assay to direct antibodies againstavian reoviruses. Experimental Pathology andParasitology, v. 518, p.35-38, 2002.HERBELLING, R. L.; KALTER, S. S.; MARX, P. A.;LOWRY, J. K.; RODRIGUEZ, A. R.  Dot-immunobindingassay compared with enzyme-linked immunosorbentassay for rapid and specific dtecttion of retrovirusesantibody induced by human or simian acquiredimmunodeficiency syndrome. Journal of ClinicalMicrobiology, v. 26, n. 4, p. 765-767, 1988.PINHEIRO, R. R. Vírus da Artrite Encefalite Caprina:Desenvolvimento e padronização de ensaiosimunienzimáticos (ELISA e Dot-Blot) e estudoepidemiológico no Estado do Ceará. 2001. 115 f. Tese(doutorado em medicina veterinária preventiva eepidemiologia) - Universidade Federal de Minas Gerais,Belo Horizonte, 2001.PINHEIRO, R. R.; OLORTEGUI, C. C.; GOUVEIA, A. M.G.; ARAÚJO, S. C.; ANDRIOLI, A. Desenvolvimento dedot-blot para detecção de anticorpos para o vírus daArtrite Encefalite Caprina. Revista Portuguesa deCiências Veterinárias, v. 101, p. 51-56, 2006.

Método do Dot-Elisa para diagnóstico da Maedi-Visna.

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Método do Dot-Elisa para diagnóstico da Maedi-Visna.

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