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Infoteca-e

199ISSN 0104-7647Junho, 2007Teresina, PIExtração Não Letal de DNA emAbelhas do Gênero MeliponaFoto: Fábio Mendonsa DinizMarineide Rodrigues Amorim1Teresa Cristina Alves Lima1Geice Ribeiro Silva2Glícia Maria Almeida3José Maria Vieira Neto4Fábia de Mello Pereira5Paulo Sarmanho da Costa Lima5Fábio Barros Brito5Maria Teresa do Rêgo Lopes5Ricardo Costa Camargo5Fábio Mendonça Diniz5IntroduçãoEntre as abelhas sociais, além da conhecida Apismellifera, estão as da tribo Meliponini, que agrupamvários gêneros de abelhas sem ferrão, tambémconhecidas como abelhas indígenas, com grandeheterogeneidade de cor, tamanho, forma, hábitos denidificação e população dos ninhos (Nogueira-Neto,1997). Habitantes das regiões tropicais e subtropicaisdo mundo, estima-se que, só no Brasil, existam maisde 300 espécies de abelhas sem ferrão (Coletto-Silva,2005). Nesse grupo, as mais conhecidas são a jandaíra(Melipona subnitida), uruçu-amarela (Meliponarufiventris), uruçu (Melipona scutellaris), tiúba(Melipona compressipes) e manduri (Melipona asilvai),todas típicas da Região Nordeste (Pereira, 2006).Algumas espécies são pouco agressivas e adaptam-sebem a colmeias racionais. Além de produzirem mel deexcelente qualidade, com potencial terapêutico, essasabelhas podem fornecer pólen, cerume, geoprópolis eos próprios enxames para a exploração comercial.A polinização é outro recurso importante fornecidopelos meliponídeos (Nogueira-Neto, 1997).Geralmente, a amostragem de DNA de abelhas baseia-se em métodos letais ou invasivos (Châline et al.,2002). Contudo, a amostragem não letal paraidentificar o DNA está tornando-se cada vez maisimportante para estudos populacionais, deconservação e de comportamento (Gerken et al.,1998; Lushai et al., 2000; Starks e Peters, 2002).Em insetos sociais, a sobrevivência dos indivíduosamostrados nem sempre é importante. Em espéciescom um grande número de operárias, como a dogênero Apis, os indivíduos podem ser sacrificados parafornecer as amostras necessárias para vários tipos deanálises genéticas, tais como, a determinação deparentesco e a relação entre a geração (Châline et al.,2004; Foster et al., 2001; Bourke et al., 1997). Noentanto, a amostragem letal pode causar problemasquando colônias pequenas são estudadas, como é ocaso das abelhas do gênero Melipona. Esse tipo de1Especialista em Genética e Evolução - Universidade Federal do Piauí – Campus Universitário Petrônio Portella B. Ininga, CEP64.049-550, Teresina, Piauí.2Bolsista do Laboratório de Biologia Molecular & Biotecnologia da Embrapa Meio-Norte, Embrapa Meio-Norte, Caixa Postal 01,CEP 64.006-220, Teresina, Piauí.3Mestranda em Ciência Animal da Universidade Federal do Piauí – Campus Universitário Petrônio Portella B. Ininga, CEP 64.049-550, Teresina, Piauí.4Estagiário do Núcleo de Pesquisa com Abelhas da Embrapa Meio-Norte, Embrapa Meio-Norte, Caixa Postal 01, CEP 64.006-220, Teresina, Piauí.5Pesquisador da Embrapa Meio-Norte, Laboratório de Biologia Molecular & Biotecnologia da Embrapa Meio-Norte, Embrapa Meio-Norte, Caixa Postal 01, CEP 64.006-220, Teresina, Piauí.2 Avaliação de cultivares de milheto na Região Litorânea do Piauí - ano 2006/2007análise também é inadequado para a genotipagem derainhas destinadas a liderar colônias ou operárias cujocomportamento subseqüente deve ser estudado(Starks e Peters, 2002). Além disso, a amostragemprolongada de uma população pode alterar a estruturada população subseqüente (Starks e Peters, 2002).Para animais pequenos como insetos, um desafiometodológico é o desenvolvimento de métodos deamostragem de tecidos que não afetem a sobrevivên-cia dos indivíduos enquanto ainda fornecem DNA dequalidade adequada para análise genética (Gerken etal., 1998). Os protocolos tradicionais de extração deDNA para o estudo de diversidade genética deMelipona comprometem o desempenho da colmeia. Noentanto, estudos revelam que a utilização das extremi-dades das asas e da porção terminal da perna (tarso)não afeta o desempenho dessas abelhas.O propósito deste trabalho foi identificar a viabilidadede protocolos de extração não letal de DNA emabelhas Melipona, utilizando-se o tarso e a extremida-de da asa, e verificar a qualidade do material extraídopara reações de polimerase em cadeia (PCR), especifi-camente uma região do DNA mitocondrial freqüen-temente utilizada em estudos de evolução molecular.Material e MétodosForam coletadas espécimens de abelhas jandaíra(Melipona subnitida), uruçu-amarela (Meliponarufiventris), uruçu (Melipona scutellaris), tiúba(Melipona compressipes) e manduri (Melipona asilvai)no campo experimental da Embrapa Meio-Norte, emTeresina, Piauí. As amostras foram armazenadas emálcool absoluto à temperatura ambiente e processadasno Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia,em Teresina, PI, onde protocolos de extração de DNAforam testados. O DNA extraído foi utilizado comomolde para amplificação da região LSUrRNA do DNAmitocondrial, visando à verificação da viabilidade domaterial extraído.Para todos os protocolos de extração, foram retiradosuma porção de 10 % da asa do indivíduo (Fig. 1) e otarso das espécies de abelha mencionadas acima.O material foi macerado em nitrogênio líquido comauxílio de pistilo para o rompimento da camada dequitina e para facilitar a exposição das células aosreagentes. A asa inteira e o tórax foram usados comopadrão de comparação.Os protocolos 1, 2 e 3, descritos por Waldschmidt etal. (1997), diferiram entre si apenas pelo tampãoutilizado nos primeiros passos da extração:n Protocolo 1: tampão A (2 % CTAB, 100 mM tris-pH 8, 20 mM de EDTA, 1,4 M de NaCl, proteinase K).n Protocolo 2: tampão B (1 % CTAB, 50 mM tris-pH 8, 10 mM de EDTA, 0,75 M de NaCl,proteinase K).n Protocolo 3: tampão C (2 % SDS, 50 mM tris-pH 8,10 mM de EDTA, 0,75 M de NaCl, proteinase K).Em cada amostra macerada em nitrogênio, foramadicionados 300 µL do tampão de extração (A, B ouC). O material foi homogeneizado em vortex poralguns minutos e foram adicionados 20 µL deproteinase K, incubando a 55 °C por 3 horas para adigestão completa das proteínas. Em seguida, adicio-naram-se 300 µL de clorofórmio-álcool isoamílico(24:1) e 300 µL de fenol (Sambrook et al. 1989).Cada tubo foi homogeneizado em vortex por 10 s emisturado por 30 minutos em agitador. Centrifugou-se a 18.600 x g por 15 minutos, transferiu-se a faseaquosa para um novo tubo e adicionaram-se 300 µLde clorofórmio-álcool isoamílico. As amostras foramnovamente homogeneizadas em vortex por 10 segundos,misturadas em agitador por 15 minutos e centrifugadasa 18.600 x g por 10 minutos. A fase aquosa foitransferida para um novo tubo, onde foram adiciona-dos 1 mL de isopropanol e 3 µL de acetato de sódio 3 M.O tubo foi invertido dez vezes e então colocado nofreezer por 30 minutos. Centrifugou-se a 7.700 x gpor 20 minutos. Descartou-se o sobrenadante e lavou-se o pellet com 1 mL de etanol 70 %. Apóscentrifugar à velocidade máxima por 15 minutosdescartou-se o etanol e secou-se o pellet àtemperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida,adicionaram-se 100 µL de tampão de eluição(Invitrogen®).Fig. 1. Vista inferior da asa de um espécime de abelhasem-ferrão (Melipona sp.) demonstrando o corte domaterial utilizado para a extração de DNA.3Avaliação de cultivares de milheto na Região Litorânea do Piauí - ano 2006/2007n Protocolo 4: Chelex®100 (Walsh et al., 1991)Volumes diferentes de solução Chelex ® 100, emdiferentes concentrações 10 % ou 20 %, foramadicionados de acordo com a natureza da amostra:100 µL para as amostras do tarso e 50 µL para asamostras da ponta da asa. As amostras foram entãoincubadas a 55 ºC por 3 horas com constanteagitação, misturadas em vortex por 20 segundos,aquecidas de 95 ºC a 100 ºC por 30 minutos emisturadas novamente em vortex por 20 segundos.Após 2 minutos de centrifugação à velocidademáxima, 18.600 x g, foram transferidos 20 µL dosobrenadante para um tubo de 200 µL.n Protocolo 5: Chelex®100  com adição de proteinaseK (Walsh et al., 1991)Antes de seguir com o protocolo original, acrescentou-se proteinase K nas amostras. Da mesma forma que oProtocolo 4, volumes diferentes de solução Chelex ®100 foram adicionados de acordo com a natureza daamostra. As amostras foram então incubadas a 55 ºCovernight e misturadas em vortex por 20 segundos.Em seguida, foram fervidas a uma temperatura entre95 ºC e 100 ºC por 15 minutos e misturadasnovamente em vortex por 10 segundos. Após 3minutos de centrifugação a 7.700 x g, transferiram-se20 µL do sobrenadante para um tubo de 200 µL.n Protocolo 6: kit de extração de DNA Puregene(Gentra®)Os procedimentos de extração do kit encontram-sedescritos em detalhes pelo fabricante em manualpróprio. Resumidamente, adicionaram-se 300 µL desolução de lise celular e 20 µL de proteinase K,incubou-se por 3 horas a 55 °C. Acrescentaram-se100 µL de solução de precipitação de proteínasseguidos de vortex e centrifugação por 16.000 x g por3 minutos O sobrenadante foi transferido para umnovo tubo e adicionaram-se 300 µL de isopropanol.   Omaterial foi novamente lavado com etanol a 70 % ecentrifugado. Descartou-se o sobrenadante, e 50 µLde Tris foram adicionados ao pellet.Após a extração, a quantidade e a qualidade do DNAobtido foram visualizadas por meio de eletroforese emgel de agarose 1 %. A viabilidade do DNA extraídocomo molde para reações de PCR foi verificada pormeio da amplificação da região LSUrRNA do DNAmitocondrial para todas as abelhas amostradas, comos iniciadores (primer) 16S-ar(5´-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3´) e 16S-br(5´-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3´), previa-mente descritos por Palumbi (1996). Em um volumede reação de  20 µL, foram usados 2,0 µL de DNAextraído, tampão para PCR 1x, 1,75 mM de MgCl2,0,5 µM de cada primer, 800 mM de cada dNTP e 1unidade de Taq DNA polimerase (Thermoprime plus,Advanced Biotechnologies). Todas as reações foramimediatamente desnaturadas a 94 ºC por 4 minutos,seguidas de 35 ciclos de desnaturação de 94 ºC por 1minuto, 50 °C de anelamento por       1 minuto eelongação de 72 ºC por 1 minuto; por último, aelongação final durante 7 minutos a 72 ºC.Após PCR, o DNA amplificado, obtido a partir de cadaprotocolo, foi visualizado em eletroforese em gel deagarose a 1%, onde o DNA foi corado com 3 µL debrometo de etídio (Sambrook et al., 1989). Utilizaram-se10 µL de cada amostra para a realização daeletroforese.Resultados e DiscussãoA extração de DNA a partir da extremidade da asa edo tarso de abelhas do gênero Melipona mostrou-seeficaz para os protocolos que utilizaram o polímeroChelex® 100 (Tabela 1). A digestão com proteinase Kmostrou ser um passo eficiente no processo deextração. A extração de DNA, por meio dosprotocolos utilizando soluções tampões (A, B e C), nãoapresentou resultados positivos, provavelmente emrazão da degradação do material genômico ou da suaperda durante o processo de extração.O resultado das amplificações da região LSUrRNA domtDNA, tendo como molde o DNA genômico extraídoa partir de 10 % da asa, pelos protocolos Chelex® 100e Chelex® 100 + proteinase K, em concentrações de10 % e 20 %, tendo como controle o DNA extraído apartir da asa inteira, mostrou-se satisfatório. Obser-vou-se que o DNA obtido com esse método permitiu avisualização de material de boa qualidade, em quehouve a formação de bandas sem padrão de smear.Entretanto, nas amostras 5A e 5B, observou-se apresença de algumas bandas que podem ter sidoocasionadas por um anelamento parcial dos primersem decorrência da diminuição da temperatura durantea PCR (Fig. 2).4 Avaliação de cultivares de milheto na Região Litorânea do Piauí - ano 2006/2007A extração de DNA do tarso usando-se o protocoloChelex® 100 + proteinase K apresentou DNA de boaqualidade (Fig. 2). No entanto, a amplificação sóocorreu em uma espécie. Isso pode ter ocorrido emrazão do processo de maceração do material, quepode não ter sido suficientemente eficaz, ou emvirtude de a quantidade de DNA extraído não ter sidosuficiente para a amplificação nas outras espécies.Na extração pelo kit Puregene, obteve-se amplificaçãode apenas duas das amostras testadas. Na primeira,observou-se a presença de bandas não específicas,que também podem ter sido amplificadas em decor-rência da baixa temperatura de anelamento durante aPCR. A não-amplificação das demais amostras pode terocorrido pela perda de DNA durante os procedimentosde extração, em que houve constante troca de tubos(Fig. 3).Fig. 2. Amplificação do DNA mitocondrial (região LSUrRNA) tendo como molde DNA extraído a partir dos protocolosChelex® 100 e Chelex® 100 + proteinase K em concentração de 10 e 20%. Os números 1, 2,  3, 4 e 5 correspondem,respectivamente, à uruçu-amarela (Melipona rufiventris), tiúba (Melipona compressipes), mandurí (Melipona asilvai),jandaíra (Melipona subnitida) e uruçu (Melipona scutellaris). A e B correspondem à porção de 10% da asa e asa inteira,respectivamente, de cada espécie citada acima. T, corresponde ao tarso de jandaíra. 1 e 2 utilizou Chelex® 100, 3, 4, 5e T utilizou Chelex® 100 + proteinase K.Protocolos* Espécie Parte do corpo 1 2 3 4 5 6 Ponta Asa − − − − + − Asa inteira − − − − + − Jandaíra (Melipona subnitida) Tarso − − − − + − Ponta Asa − − − + − − Asa inteira − − − + − − Uruçu-amarela  (Melipona rufiventris) Tarso − − − − − − Ponta Asa − − − − + + Asa inteira − − − − + − Uruçu (Melipona scutellaris) Tarso − − − − − − Ponta Asa − − − − − − Asa inteira − − − + − − Tiúba (Melipona compressipes) Tarso − − − − − − Ponta Asa − − − − − + Asa inteira − − − − − − Manduri (Melipona asilvai)  Tarso − − − − − −  Tabela 1. Comparação entre os protocolos utilizados.  O sinal positivo (+) indica a ocorrência de amplificação deDNA. O sinal de negativo (–) indica a ausência de amplificação.*1: Waldschmidt et al. (1997) – Tampão A; 2: Waldschmidt et al. (1997) – Tampão B; 3: Waldschmidt et al. (1997) – TampãoC; 4: Chelex®100 (Walsh et al., 1991); 5: Chelex®100 (Walsh et al., 1991) com adição de proteinase K; 6: Puregene (Gentra®).5Avaliação de cultivares de milheto na Região Litorânea do Piauí - ano 2006/2007Os métodos de amostragem não letais de DNA deindivíduos de abelhas do gênero Melipona são requeri-dos tanto por estudos de conservação genética comode comportamento. Verificou-se que a regiãoLSUrRNA do DNA mitocondrial poderia ser amplificadaconfiavelmente da ponta da perna (tarso) e da asa deabelhas Melipona.Os protocolos Chelex® 100 e Chelex® 100 +proteinase K extraíram DNA de qualidade e emquantidade suficiente para a utilização do materialcomo molde para reações de PCR. O protocoloChelex® 100 apresenta grande vantagem uma vez queo tempo de extração é extremamente curto emrelação aos demais, alem do baixo custo. No entanto,a amplificação não ocorreu com todas as espécies deabelhas citadas, indicando a necessidade deotimização desse protocolo a outras espécies domesmo gênero.ReferênciasBOURKE, A.F.G.; GREEN H.A.A.; BRUFORD M.W. Parentage,reproductive skew and queen turnover in a multiple-queen antanalysed with microsatellites, Proc. R. Soc. London B 264,277-283, 1997.CHÂLINE, N.; RATNIEKS, F.L.W.; BURKE, T. Anarchy in theUK: Detailed genetic analysis of worker reproduction in anaturally occurring British anarchistic honeybee, Apismellifera, colony using DNA microsatellites. Mol. Ecol. 11,1795-1803, 2002.CHÂLINE, N.; RATNIEKS, F.L.W.; RAINE, N.E.; BADCOCK,N.S.; BURKE, T. Non-lethal sampling of honey bee, Apismellifera, DNA using wing tips. Apidologie 35, 311-318, 2004.COLETTO-SILVA, A. Captura de Enxames de Abelhas SemFerrão (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae) sem Destruiçãode Árvores. Acta Amazonica, 35(3): 383 – 388, 2005.FOSTER, K.R.; RATNIEKS, F.L.W.; GYLLENSTRAND, A.;THOREN P.A. 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Duque de Caxias, 5.650, BairroBuenos Aires, Caixa Postal 01, CEP 64006-220Teresina, PI.Fone: (86) 3225-1141Fax: (86) 3225-1142E-mail: sac@cpamn.embrapa.br1a edição1a impressão (2006): 120 exemplaresPresidente: Hostón Tomás Santos do Nascimento.Secretária: Executiva: Ursula Maria Barros de AraújoMembros: Paulo Sarmanho da Costa Lima, HumbertoUmbelino de Sousa, Fábio Mendonça Diniz, Flávio FlavaroBlanco, Cristina Arzabe, Eugênio Celso Emérito deAraújo, Danielle Maria Machado Ribeiro Azevêdo e CarlosAntônio Ferreira de SousaSupervisor editorial: Lígia Maria Rolim BandeiraRevisão de texto: Lígia Maria Rolim BandeiraEditoração eletrônica: Erlândio Santos de ResendeNormalização bibliográfica: Orlane da Silva MaiaMinistério da AgriculturaPecuária e AbastecimentoSAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.E.; MANIATIS, T. MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring HarborLab. Press, New York, 1989.STARKS, P.T.; PETERS, J.M. 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Extração não-letal de DNA em abelhas do gênero melipona.

http://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/68080/1/CT199.pdf

Extração não-letal de DNA em abelhas do gênero melipona.

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