GUIMARAES, C. T.

PADILHA, L.

PAIVA, E.

SOUZA, I. R. P. de

Infoteca-e

ComunicadoTécnico92ISSN 0101-5605Maio, 2004Sete Lagoas, MG1 Eng. Agr., Doutora, Genética e Melhoramento de Plantas,  Embrapa Milho e Sorgo Caixa Postal  151 CEP 35 701-970  Sete Lagoas, MG.  E-mail:claudia@cnpms.embrapa.br2 Eng. Agr., Doutora, Fitotecnia,  Embrapa Milho e Sorgo Caixa Postal  151 CEP 35 701-970  Sete Lagoas, MG.  E-mail: lilian@cnpms.embrapa.br3 Eng. Agr., Ph.D. Fitomelhoramento,  Embrapa Milho e Sorgo Caixa Postal  151 CEP 35 701-970  Sete Lagoas, MG.  E-mail: isabel@cnpms.embrapa.br4 Eng. Agr., Ph.D., Biologia Molecular de Plantas,  Embrapa Milho e Sorgo Caixa Postal  151 CEP 35 701-970  Sete Lagoas, MG.  E-mail:edilson@cnpms.embrapa.brOs programas de melhoramento vegetal sãoprocessos que requerem elevados investimen-tos financeiros e intelectuais para a geraçãode cultivares e híbridos com alto valor agrega-do. Assim, torna-se necessário caracterizar, demaneira precisa e inequívoca, as novas culti-vares, visando minimizar os riscos de apropria-ção indevida e estimulando, com isso, novosinvestimentos, para um contínuo desenvolvi-mento de genótipos superiores e mais adapta-dos.Com a aprovação da Lei de Proteção de Culti-vares, Nº 9.456, de 25 de abril de 1997 (Bra-sil, 1997), foi instituído o direito à proteçãode cultivares, cuja caracterização é realizadapor meio de descritores que atendem aoscritérios de distinguibilidade, homogeneidadee estabilidade, ao longo de gerações sucessi-vas. Atualmente, a proteção de genótipos demilho é oficialmente realizada por meio decaracterísticas morfológicas. Estas apresentam“Fingerprinting” Molecular deLinhagens de MilhoClaudia Teixeira Guimarães1Lilian Padilha2Isabel Regina Prazeres de Souza3Edilson Paiva4como principais desvantagens a necessidadede um grande número de descritores, queserão identificados na planta adulta, além dotempo e do espaço físico necessários para aavaliação do material. Associada a isto, aindaexiste a influência do ambiente, que poderálevar à geração de resultados pouco confiáveispara os marcadores morfológicos.A introdução de técnicas moleculares paracaracterizar e identificar cultivares é um pro-cesso atual e, apesar de ainda não ser reco-nhecida como metodologia oficial, vem sendofortalecida em função do alto grau de preci-são e informação que pode ser obtido pelo“fingerprinting” molecular. O “fingerprinting”ou genotipagem molecular é a “impressãodigital” de um determinado genótipo, quepermite a obtenção de seu perfil genético esua diferenciação inequívoca de outrogenótipo.2 “Fingerprinting” Molecular de Linhagens de MilhoOs métodos que utilizam diretamente o DNAapresentam grandes vantagens, por não seremafetados pelo ambiente e por apresentaremum elevado poder de discriminação (Ferreira eGrattapaglia, 1998). Dentre os marcadoresmoleculares disponíveis, os microssatélites ouSSR (Seqüências Simples Repetidas) são osmais indicados para a diferenciação varietal.Esses marcadores são baseados em umametodologia simples e rápida, que geramarcadores com elevado conteúdo de infor-mação genética e amplamente distribuídos nogenoma do milho. Tal metodologia é rotineira-mente utilizada nas elucidações de processosde paternidade humana, em que alcança umamplo respaldo jurídico e forense.Com relação aos aspectos genéticos, osmicrossatélites são uma classe de marcadoresque consistem de pequenas seqüências denucleotídeos repetidas em tandem eamplamente distribuídas no genomaeucarioto. Cada microssatélite constitui umloco genético altamente polimórfico, cujosdiferentes alelos são resultantes das variaçõesno número dessas repetições (Senior et al.,1998; Smith et al., 1997).As regiões de SSR são delimitadas porseqüências de DNA conservadas, para as quaissão desenhados primers que serão utilizadospara amplificação dos microssatélites. Essasamplificações dos locos SSR são realizadaspor meio de reações em cadeia da polimerasedo DNA (PCR). Os fragmentos amplificadossão, então, separados por eletroforese em géisde agarose (Figura 1) ou poliacrilamida (Figura2), revelando os diferentes alelos. Éimportante realçar que o DNA a ser utilizadona reação de PCR pode ser extraído a partir depequenas quantidades do material biológico,sementes ou folhas e em qualquer estádio dedesenvolvimento da planta.Além da alta resolução genética, outra vanta-gem da técnica SSR é que a mesma pode sersemi-automatizada, o que aumenta a capaci-dade para processamento de dados. Essasemi-automatização refere-se, principalmente,à extração e análise automática dos dados porprogramas computacionais, reduzindo, comisso, a chance de erros provocados pela mani-pulação humana dos resultados. Em tais siste-mas, são utilizados primers marcados comfluorescências de colorações diferentes, quepodem ser combinados para o processamentosimultâneo das amostras, aumentando a efici-ência do mesmo.A captura das informações é realizada pelaleitura dos fragmentos fluorescentes por umsistema a laser, no seqüenciador automáticode DNA. Um padrão de peso molecular, tam-bém marcado com fluorescência, é avaliadojuntamente com cada uma das amostras,garantindo a quantificação precisa do tama-nho dos fragmentos.Figura 1. Padrão multialélico dos marcadores microssatélites entre linhagens (L) de milho. A)Os fragmentos amplificados foram separados em gel de agarose, tratado com brometo deetídio e visualizados sob luz ultravioleta. B) Os fragmentos foram separados em gel depoliacrilamida 8% não desnaturante, contendo 1X Spreadex Polymer NAB (Elchrom Scientific)e corado com brometo de etídio. M é o padrão de peso molecular 25 pb Ladder3“Fingerprinting” Molecular de Linhagens de MilhoFigura 2. Padrão de amplificação dos marcadores microssatélites utilizando primers fluorescen-tes. A) Três locos SSR com as fluorescências azul, verde e amarela, visualizados em gel depoliacrilamida, no seqüenciador automático de DNA. B) Combinação de seis locos SSR marca-dos com fluorescência e visualizados em único gel de poliacrilamida no seqüenciador automáti-co de DNA.No sistema semi-automatizado, é possívelvisualizar e analisar até três produtos amplifi-cados numa mesma faixa de tamanho para osfragmentos ou, ainda, serem combinadoslocos com diferentes amplitudes de tamanho,aumentando, assim, o número de marcas quepodem ser analisadas em um gel (Figura 2).Outra característica favorável diz respeito àresolução do sistema, possuindo a precisão deum nucleotídeo em uma faixa de tamanhoentre 50 e 500 bases.Variações nas regiões SSR, resultantes dosdiferentes números de alelos detectados porloco genético, apresentam elevado poderdiscriminatório e, normalmente, poucos locosgarantem a completa diferenciação dosgenótipos de interesse. Essa característica éum fator importante, considerando a necessi-dade de discriminação de cultivares muitopróximas ou essencialmente derivadas.Em milho, para a definição de“fingerprintings” únicos para cada uma das 94linhagens avaliadas por Senior et al. (1998),apenas cinco locos de SSR foram necessários.Analisando 35 linhagens-elite de milho doPrograma de Melhoramento da Embrapa Milhoe Sorgo, foram identificados dois primersmicrossatélites que permitiram a diferenciaçãocompleta de todas as linhagens (Padilha,2002). Além da identificação das linhagens edo auxílio aos processos de Proteção de Culti-vares, a análise com marcadores molecularespermite o estudo da diversidade genéticadentro do germoplasma-elite.Referências bibliográficasBRASIL. Lei n. 9.456, de 25 de abril de 1997.Institui a Lei de Proteção de Cultivares e dáoutras providências. Brasília, DF: SenadoFederal, 1997. p. 15-30.FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D.Introdução ao uso de marcadores molecularesem análises genéticas. 3. ed. Brasília, DF:EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 220 p.RUSSELL, J.; FULLER, J.; YOUNG, G.;THOMAS, B.; TARAMINO, G.; MACAULAY,M.; WAUGH, R.; POWELL, W. Discriminatingbetween barley genotypes using microsatellitemarkers. Genome, Ottawa, v. 40, n. 4, p. 442-450, 1997.SENIOR, M. L.; MURPHY, J. P.; GOODMAN,M. M.; STUBER, C. W. Utility of SSRs fordetermining genetic similarities andrelationships in maize using an agarose gelsystem. Crop Science, Madison, v. 38,p.1088-1098, 1998.SMITH, J. S. C.; CHIN, E. C. L; SHU, H.;SMITH, O. S.; WALL, S. J.; SENIOR, M. L.;MITCHEL, S. E.; KRESOVICH, S.; ZIEGLE, J.An evaluation of the utility of SSR loci asmolecular markers in maize (Zea mays L.):comparisons with data from RFLPs andpedigree. Theoretical and Applied Genetics,Berlin, v. 95, p. 163-177, 1997.4 “Fingerprinting” Molecular de Linhagens de Milho  Comitê dePublicaçõesPresidente:  Jamilton Pereira dos SantosSecretário-Executivo: Paulo César MagalhãesMembros: Camilo de Lélis Teixeira de Andrade, CláudiaTeixeira Guimarães, Carlos Roberto Casela, José CarlosCruz e Márcio Antônio Rezende MonteiroExpediente Revisão de texto: Dilermando Lúcio de OliveiraEditoração eletrônica:  Dilermando Lúcio de OliveiraComunicadoTécnico, 92Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Milho e SorgoCaixa Postal 151 CEP 35701-970 Sete Lagoas, MGFone: 0xx31 3779 1000Fax: 0xx31 3779 1088E-mail: sac@cnpms.embrapa.br1ª edição1ª impressão (2004) Tiragem: 200

"Fingerprinting" molecular de linhagens de milho.

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