bitstream/CTAA-2009-09/9978/1/ct100-2006.pd

CASTRO, I. M. de

STEPHAN, M. P.

Infoteca-e

Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoOtimização da Detecção deIsotiocianatos na Análise porCG-DNP100ISSN 0103-5231Dezembro, 2006Rio de Janeiro, RJ1Quím., Ph.D., Pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Av. das Américas, 29501, CEP 23.020-470,Rio de Janeiro, RJ. E-mail: imcastro@ctaa.embrapa.br2 Farm., Ph.D., Pesquisadora da Embrapa Agroindústria de Alimentos. E-mail: stephan@ctaa.embrapa.brIzabela Miranda de Castro1Marília Penteado Stephan2Os glicosinolatos (beta-tioglicosídio-N-hidroxissulfatos)são precursores dos isotiocianatos e ocorrem emdezesseis famílias de espécies vegetais. Uma grandeparte das espécies que sintetizam estas substânciaspertencem aos gêneros Brassicaceae, Caricaceae eCapparaceae (FAHEY; ZALKMANN; TALALAY,2001). Os glicosinolatos são convertidos na planta emisotiocianatos por ação da enzima mirosinase. Estaenzima, presente no próprio vegetal ou na microflorado trato digestivo humano, inicia sua atividade quandoo tecido vegetal sofre algum tipo de injúria ou sobação de fungos ou ainda mastigação de insetos ou pelaprópria mastigação das plantas frescas (BONES;ROSSITER, 1996). No caso do mamoeiro (Caricapapaya), o isotiocianato de benzila (BITC), formado apartir do glicosinolato de benzila sob a ação damirosinase no mamão, já foi relatado por apresentaratividade anti-helmíntica (KERMANSHAI et al., 2001).Durante os últimos vinte anos, muitas evidênciasforam mostradas ressaltando que o aumento doconsumo de frutas e vegetais reduz a incidência decâncer (TALALAY, 1999), em alguns casos na ordemde 50%. As propriedades químio-protetoras dosvegetais são atribuídas à presença de substânciascomo os glicosinolatos. Alguns destes (por exemplo oglicosinolato de benzila, de p-hidroxibenzila e de 2-hidroxibut-3-enila) induzem os mecanismos dedesintoxicação celular da Fase 2 (WATTENBERG etal., 1986; TAWFIQ et al., 1995; FAHEY; ZHANG;TALALAY, 1997), induzindo, por conseqüência, osmecanismos químicos de defesa contra agentescancerígenos, aumentando a resistência celular.Outros metabólitos atuam como indutores das enzimasda Fase 2 do mecanismo de desintoxicação celular,mas têm papel inibitório das enzimas da Fase 1(GAMET-PAYRASTRE et al., 2000; NAKAMURA etal., 2000). Alimentos que são reconhecidas fontes deglicosinolato e isotiocianatos foram descritos, porserem capazes de ativar o mecanismo dedesintoxicação celular e de proteger contra o câncer(SHAPIRO et al., 2001).O mamão faz parte da nossa dieta diária e éreconhecida fonte de glicosinolatos e isotiocianatos. Aatividade funcional atribuída a essas substânciassuscita o interesse em se estabelecer métodosvalidados para sua quantificação. Um método deanálise de isotiocianato de benzila utilizandocromatografia gasosa com um detetor de fotometriade chama (CG-DFC), já foi estabelecido anteriormentepor Castro, Anjos e Silva (2005) e adapta-se bem paraa matriz mamão. Neste método, no entanto, observa-se que é difícil efetuar a quantificação do isotiocianatoem concentrações baixas. Isto levou a desenvolver opresente método, utilizando um outro detetor –detector de nitrogênio-fósforo (DNP) - que tem maiorsensibilidade que o DFC usado no método original.Método de Análise de IsotiocianatosAs amostras de mamão ainda verdes foram adquiridasno mercado local. Depois de retiradas as sementes, a2Características Físicas de Extrusados de Arroz e Inulinapolpa e a casca foram cortadas em pequenos cubos,imediatamente antes da análise. A extração foi feitausando-se cerca de 20g de amostra (polpa+casca)com acetato de etila, durante quinze minutos no Ultra-Turrax. Após filtração em papel de filtro rápido, asolução foi evaporada em rota-evaporador etransferida para balão volumétrico de 10 ou 25mLcom acetato de etila. A solução contendo o analito foiaplicada em um sistema cromatográfico compostopor: cromatógrafo gasoso Trace 2000 fabricado pelaThermo® equipado com a) um detetor de fotometria dechama com filtro de enxofre (sistema CG-DFC) ou b)detetor de nitrogênio fósforo (sistema CG-DNP);coluna J&W Scientific DB-1701 P (28,5m x 0,32µm x0,25µm); programação de temperatura, 50 a 130°C(25°C/min) e de 130 a 200°C (5°C/min); injetor semdivisão de fluxo a 225°C (tempo de abertura daválvula - 1min); volume injetado - 0,8µL.Os extratos da amostras de mamão foram analisadosem duplicata por CG-DFC e por CG-DNP equantificados por padronização externa. As curvaspadrão de BITC, obtidas nos dois sistemas, foramconstruídas usando triplicatas.Quantificação Usando o Sistema CG-DFCNo primeiro método desenvolvido utilizando o detetorDFC que é seletivo para o enxofre, obteve-se a curvapadrão com sete pontos exposta na Figura 1. Vê-seque para os dois pontos de menor concentração (série1 da Figura 1), a resposta do detector é similar masdifere da obtida para os pontos mais concentrados(série 2 da Figura 1), ou seja, os fatores de respostado DFC nas faixas de baixa e alta concentração doanalito são diferentes. Assim, calculando o valor docoeficiente de correlação (R²) para diferentes faixasde concentração, determinou-se a faixa de linearidadeda curva (15,53 a 56,2µg BITC/mL), que correspondeaos cinco pontos de maior concentração. A curva decalibração apresentou um R² de 0,987, o que éconsiderado aceitável para a faixa de trabalho usada.Neste sistema cromatográfico foram analisadasamostras de mamão seguindo o protocoloexperimental previamente descrito. A identificação dopico de interesse - BITC - nas amostras de mamão,ocorreu através da comparação entre os tempos deretenção do padrão e os tempos de retenção dos picosobservados nos cromatogramas das amostras. Como odetector DFC é seletivo e só responde às substânciassulfuradas, obtêve-se cromatogramas “limpos” sem apresença de interferentes (CASTRO; ANJOS; SILVA,2005).O valor médio da concentração de isotiocianato debenzila nas amostras de mamão analisados por CG-DFC foi de 17µg de BITC/g amostra. Este resultado écoerente com dados publicados por Nakamura et al.(2000) para o mamão papaya, demostrando assim obom desempenho do método usado. Entretanto,considerando tanto a equação da reta (coeficientesangular e linear) como a faixa de linearidade, vê-seque a análise por CG-DFC não pode ser aplicada paradiluições onde o analito esteja presente na soluçãofinal em concentrações <15µg/mL. Para resolver esteproblema foi desenvolvido um novo método queapresenta maior sensibilidade que o sistema com DFC.Novo Método: Determinação deIsotiocianatos por CG-DNPA curva padrão de BITC para o sistema CG-DNP seencontra na Figura 2. A maior sensibilidade destedetector é claramente visualizada pelas áreas dospicos. Usando a mesma faixa de concentração deBITC, para efeito de comparação entre os doisdetectores, vê-se que utilizando o DNP as áreas dospicos são dez vezes maiores do que com o DFC. Amaior sensibilidade do DNP possibilita a obtenção deum fator de resposta bem melhor, permitindo aquantificação de concentrações bem mais baixas doque no método original. O coeficiente linear daequação da reta obtida pela regressão da curva épositivo e o valor de R² é 0,9964. Estes resultados sãocoerentes com as recomendações para análise detraços.O fato mais importante que deve ser ressaltado nométodo proposto é a ausência do “efeito de matriz”. ODNP é um detector seletivo e detecta apenassubstâncias que contenham nitrogênio ou fósforo. Estacaracterística permitiu, no caso da matriz mamão, aFig. 1. Curva de calibração de BITC no sistema CG-DFC3Características Físicas de Extrusados de Arroz e Inulinaobtenção de um cromatograma onde não se observamoutros picos além do BITC, facilitando a quantificaçãodo mesmo. A Figura 3 mostra o cromatograma obtidoneste sistema. A especificidade do detetor utilizado ea própria natureza da matriz estudada propiciam aobtenção de cromatogramas isentos da presença deinterferentes. As análises de BITC, efetuadas em 42amostras de mamão cultivados de forma orgânica econvencional, permitiram a determinação do teormédio de 23µg de BITC/g de amostra. Este valor éligeiramente superior ao obtido anteriormente usandoCG-DFC, mas esta diferença poderia ser atribuída àvariabilidade entre os frutos, à sazonalidade, à origeme/ou à forma de cultivo. Observou-se certa tendênciade se encontrar concentrações mais elevadas deisotiocianatos para os frutos cultivados de formaorgânica do que para as amostras provenientes docultivo convencional.Considerações FinaisO método proposto para análise de isotiocianatos,utilizando o sistema cromatográfico CG-DNP,demonstrou ser simples de ser executado. Ficouevidente a maior sensibilidade e fator de resposta dodetector de N e P frente ao analito do que o detectorDFC, usado no método original. Observou-selinearidade na faixa de concentração usualmenteencontrada neste tipo de matriz. A determinação deisotiocianato de benzila por CG-DNP, demonstrou serbastante adequada, tendo sido quantificadasconcentrações baixas de BITC em algumas amostrasde mamão sem se detectar a presença de nenhuminterferente.Fig. 2. Curva de calibração de BITC no sistema CG-DNPFig. 3. Cromatograma do BITC em uma amostra de mamão nosistema CG-DNP4Características Físicas de Extrusados de Arroz e InulinaReferências BibliográficasBONES, A. M.; ROSSITER, J. T. The myrosinase-glucosinolate system, its organisation andbiochemistry. Physiologia Plantarum, v. 97, p. 194-208, 1996.CASTRO, I. M.; ANJOS, M. R.; SILVA, A. A..Determinação de isotiocianato de benzila por CG-DFCem Carica papaya. In: REUNIÃO ANUAL DASOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 28., 2005,Poços de Caldas, MG. Livro de resumos... Poços deCaldas: SBQ, 2005.FAHEY, J. W.; ZALKMANN, A. T.; TALALAY, P. Thechemical diversity and distribution of glucosinolatesand isothiocyanates among plants. Phytochemistry, v.56, p. 5-51, 2001.FAHEY, J. 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Press, 1986. p. 193-203.Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Agroindústria de AlimentosEndereço: Av. das Américas, 29.501 - Guaratiba                23020-470  -  Rio de Janeiro  -  RJFone: (0XX21) 2410-9500Fax: (0XX21) 2410-1090 / 2410-9513Home Page:  http:\\www.ctaa.embrapa.brE-mail:  sac@ctaa.embrapa.br1a edição1a impressão (2006): tiragem (50 exemplares)Presidente:  Virgínia Martins da MattaMembros:   Marcos José de Oliveira Fonseca, MaríliaPenteado Stephan, Márcia Nitschke, Ronoel Luiz deO. Godoy e André Luis do Nascimento GomesSecretárias:  Renata Maria Avilla Paldês e CéliaGonçalves FernandesSupervisor editorial:  André Luis do N. GomesRevisão de texto: Comitê de PublicaçõesNormatização bibliográfica: Luciana S. de AraújoEditoração eletrônica:  André Guimarães de Souza eAndré Luis do N. GomesComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 100Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 5958

Otimização da detecção de isotiocianatos na análise por CG-DNP.

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