FERNANDES, K. V. S.

OLIVEIRA, E. A. G. de

PINTO, M. dos S. T.

RIBEIRO, J. M.

Portuguese

Procedimento para a extração de fluido intercelular; Observações importantes para o procedimento descrito no protocolo de extração do fluido de lavagemintercelular (FLI)

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Adaptação de um protocolopara extração do fluido delavagem intercelular (FLI) deplantas de VignaunguiculataJuliana Martins Ribeiro1Eduardo Alves Gamosa de Oliveira2Kátia Valevski Sales Fernandes3Márcio dos Santos Teixeira Pinto41 Bióloga, D.Sc. em Produção Vegetal, Embrapa Semiárido, BR 428, km 152, Zona Rural, CEP: 56302-970, Petrolina, PE, e-mail:juliana.ribeiro@cpatsa.embrapa.br.2 Bolsista BFT FACEPE, Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Embrapa Semiárido, Petrolina, PE. e-mail: eduardobio@yahoo.com.br.3Pesquisadora Bioquímica de Plantas, Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Camposdos Goytacazes, RJ. e-mail: cowpkat@uenf.br.4Bolsista DCR FACEPE/CNPq, Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Embrapa Semiárido, Petrolina, PE, e-mail: marciostp@yahoo.com.br.141ISSN 1808-9984Petrolina, PEDezembro, 2010ComunicadoTécnicoOn lineO ambiente apoplástico corresponde a todo meioexistente entre as membranas celulares das célulasvegetais, constituindo-se do espaço entre membranasjuntamente com aquele ocupado pelas paredescelulares. O meio apoplástico é, normalmente, rico emproteínas de defesa, como aquelas ricas em resíduosde hidroxiprolina (WOJTASZEK et al., 1997),inibidores de proteinase serínicas (SEGARRA et al.,2003); quitinases e glucanases ß- 1,3 (CAWOOD etal., 2010), proteínas comumente relacionadas àsdefesas contra patógenos.  O estudo da fisiologiavegetal pode ter grandes contribuições em outrostipos de análises, como exemplo, a relação davariação do íon ferro no meio apoplástico de plantasde Beta vulgaris com carência deste elemento (LARBIet al., 2010).O fluido de lavagem intercelular (FLI), obtido a partirde ambiente intercelular apoplástico de tecidosvegetais frescos, é considerado uma fonte apropriadapara a investigação de proteínas relacionadas com adefesa de plantas contra patógenos invasivos. Dessaforma, o objetivo deste trabalho foi efetuar umaadaptação de um método para extração de fluido delavagem intercelular de plantas de feijão-de-corda(Vigna unguiculata L.) a partir da metodologiaempregada para a extração de FLI de plantas de trigo(WÄLTI et al., 2002). A adaptação aqui referida foi ainserção dos procedimentos de diálise e liofilização nametodologia original (WÄLTI et al., 2002), o quepromoveu a concentração de macromoléculas taiscomo proteínas, antes diluídas na metodologia inicial,ao mesmo tempo eliminando contaminantes de baixopeso molecular. Tal procedimento possibilitou acaracterização destas moléculas por análise deeletroforese (SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970) cujosresultados foram apresentados como palestra durantea 33a Reunião Anual da Sociedade Brasileira deBioquimíca e Biologia Molecular- SBBq (PINTO et al.,2004).IntroduçãoFoto: Juliana Martins Ribeiro2 Adaptação de um Protocolo Para Extração do Fluido de Lavagem Intercelular (FLI) de Plantas de VignaunguiculataProcedimento para a extração defluido intercelular1) Destacar unifoliatos de feijão-de-corda, com novedias de idade cultivados em casa de vegetação, pormeio de corte em seus pecíolos com uma lâminanunca antes usada (Figura 1a).2) Realizar um novo corte na região próximo à basefoliar (Figura 1b).3) Submergir os unifoliatos no tampão de extração(acetato de sódio 0,14 M pH 5,5; 0,5 M NaCl; Tween20 0,3% e ß-mercaptoetanol 0,02% a 0 oC) com oauxilio de tubos de ensaio preenchidos com água, deforma a mantê-los no fundo de um kitassato quedeverá ter sua boca superior fechada com uma rolhade borracha.4) Submeter o sistema a um tratamento de baixapressão (-5 kPa), fazendo uso de uma bomba devácuo, por um período de 3 a 5 minutos.5) Após o tratamento de baixa pressão, os unifoliatosdevem ser retirados do meio e cuidadosamentetransferidos para seringas de 5 mL (Figura 1c), e estasdeverão ser introduzidas em tubos de centrífuga de 15mL . Nesta etapa, ter o cuidado de dobrar a ponta dounifoliato para o espaço entre a seringa e o tubo paraque este não deslize para o fundo do tubo durante acentrifugação (Figura 1d).6) Submeter os tubos à centrifugação (700 x g, 5 min,4o C) (Figura 1e).7) Após a centrifugação, o FLI deverá ser coletado dofundo do tubo de centrífuga, fazendo-se uso demicropipeta (Figura 1f).8) Após a coleta do FLI, este deverá ser dialisado emsacos de diálise de acetato de celulose, em um Beckercom 2.000 mL de água destilada. A água destiladadeverá ser trocada a cada 12 horas por três vezes eeste procedimento deverá ser efetuado dentro degeladeira (4 oC). Após diálise, o FLI deverá serconcentrado por liofilização.Figura 1. Processo de extração de fluido de lavagem intercelular (FLI). a)Unifoliato de feijão-de-corda; b) unifoliato de feijão-de-corta corte basal; c)unifoliato acoplado a parte superior de uma seringa; d) seringas do item cdentro de um tubo de centrifuga; e) Centrifugação em baixa rotação; f) FLIobtido no fundo do tubo.Desenho: Márcio S. T. Pinto3Adaptação de um Protocolo Para Extração do Fluido de Lavagem Intercelular (FLI) de Plantas de VignaunguiculataObservações importantes para oprocedimento descrito no protocolode extração do fluido de lavagemintercelular (FLI)- Após o corte do unifoliato com uma lâmina nova, aparte ferida deve ser lavada exaustivamente comágua destilada, de maneira a remover todo materialcelular presente na área ferida.- Medidas que minimizem a ruptura do tecido vegetaldeverão ser adotadas, evitando-se assim, acontaminação com proteínas do meio intracelular,sendo elas:a) Cautela com a manipulação das partes destacadas,evitando dobramento muito fechado do material e,consequentemente, ruptura de tecido.b) Nunca congelar o tecido vegetal antes da extraçãode FLI. Isso acarreta a ruptura de células e da paredecelular através dos cristais de gelo formados, além dealterações do meio apoplástico.c) Manter o material em gelo durante o período depreparação, para minimizar as degradações porautólise.d) Durante o tratamento de baixa pressão, nãosubmeter o material a tempos  prolongados ou grandesdiferenças de pressões, pois, o tempo e a pressãopodem variar em função da rigidez do tecido. Tecidosmais delgados e frágeis, como folhas, exigem menorespressão e tempo de procedimento. Embora não hajauma tabela relacionando os valores de pressão usadospara cada espécie vegetal, é possível monitorar oprocedimento por meio da ocorrência de substânciasexistentes somente no meio intracelular como, porexemplo, a RUBISCO em folhas. A detecção destaenzima em FLI significa que houve ruptura de tecido eum valor menor de pressão deverá ser adotado.- Durante o tratamento com baixa pressão, a parteabaxial das folhas ou unifoliatos destacados devemficar, preferencialmente, voltados para cima,permitindo, assim, a saída de ar do tecido. Para folhasque apresentem uma distribuição estomática similarnos dois lados, este procedimento é desnecessário.- Os unifoliatos devem ser secos com papel toalhalimpo antes de serem colocados no topo da seringa.- Todo o procedimento descrito acima deve serexecutado usando-se luvas de látex, para evitarcontaminações pelo manuseio.- Apesar de o material modelo citado ser unifoliato defeijão-de-corda, este procedimento de extração podeser realizado em diferentes partes da planta, bemcomo em outras espécies vegetais, desde que sejamfeitas adaptações necessárias em função da anatomiadestas.- Análises de micromoléculas presentes em fluidointercelular deverão ser feitas com o extrato obtidodiretamente, sem a necessidade de realização dediálise.Durante o processo de diálise, todas as substânciascontidas no FLI com massas moleculares inferiores a10.000 Da, tendem a difundir por todo meio aquoso,somente as moléculas de massas moleculares maioresque este valor permanecem no interior do saco dediálise.ReferênciasCAWOOD, M. E.; PRETORIUS, J. C.; WESTHUIZEN, A. J.van der; PRETORIUS, Z. A. Disease development and PR-protein activity in wheat (Triticum aestivum) seedlingstreated with plant extracts prior to leaf rust (Pucciniatriticina) infection. Crop Protection, [Amsterdam], v. 29, p.1.311-1.319, 2010.LAEMMLI, L. I. Cleavage of structural proteins duringassembly of the head of bacteriophage. Nature, London, v.227, p. 680-685, 1970.LARBI, A.; MORALES,  F.; ABADÍA, F. A.;  ABADÍA,  J.Changes in iron and organic acid concentrations in xylem sapand apoplastic fluid of iron-deficient Beta vulgaris plants inresponse to iron resupply. Journal of Plant Physiology,[London], v. 167, p. 255-260, 2010.LOPEZ-MILLAN, A. F.; MORALES F.; ABADÍA, A.; ABADÍA,J. Iron deficiency associatedchanges in the composition ofthe leaf apoplastic fluidfrom field pear (Pyrus communis L.)trees. Journal of Experimental Botany, London, v. 52, p.1.489-1.498, 2001.PINTO, M. S. T.; RIBEIRO, J. M.; GOMES, V. M.;MACHADO, O. L. T.; XAVIER FILHO, J.; FERNANDES, K. V.S. Protein from cowpea plants (Vigna unguiculata-EPACE-10)is immunorelated to 2s albumins from castor bean (Ricinuscomunis). In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRADE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR, 33., 2004,Caxambu. Programa e resumos... Caxambu: SBBq, 2004. 1CD-ROM.4 Adaptação de um Protocolo Para Extração do Fluido de Lavagem Intercelular (FLI) de Plantas de VignaunguiculataEsta publicação está disponibilizada no endereço:http://www.cpatsa.embrapa.brExemplares da mesma podem ser adquiridos na:Embrapa SemiáridoEndereço: C.P. 23, 56302-970, Petrolina, PEFone: (87) 3862-1711Fax: (87) 3862-1744sac@cpatsa.embrapa.br1a edição (2010): Formato digitalComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 141Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoCGPE 8980Presidente: Maria Auxiliadora Coêlho de Lima.Secretário-Executivo: Josir Laine Aparecida Veschi.Membros: Daniel Terao.Tony Jarbas Ferreira Cunha.Magna Soelma Bezerra de Moura.Lúcia Helena Piedade Kiill.Marcos Brandão Braga.Gislene Feitosa Brito Gama.               Mizael Félix da Silva Neto.Supervisor editorial: Sidinei Anunciação Silva.Revisão de texto: Sidinei Anunciação Silva.Tratamento das ilustrações: Nivaldo Torres dos Santos.Editoração eletrônica: Nivaldo Torres dos Santos.MINISTÉRIO DA AGRICULTURA,PECUÁRIA E ABASTECIMENTOSEGARRA, C.; CASALONGUÉ, C.; PINEDO, M; RONCHI, V.;CONDE R.D. A germin-like protein of wheat leaf apoplastinhibits serine proteases. Journal Experimental Botany,London, v. 54, p. 1.335-1.341, 2003. WÄLTI, M.; ROULIN, S.; FELLER, U. Effects of pH, light andtemperature on (1->3,1->4)- ß-glucanase stability in wheatleaves. Plant Physiology and Biochemistry, Paris, v. 40, p.363-371, 2002. WOJTASZEK, P.; TRETHOWAN, J.; BOLWELL, G. P.Reconstitution in vitro of the components and conditionsrequired for the oxidative cross-linking of extracellularproteins in French bean (Phaseolus vulgaris L.). FEBS Letters,Amsterdam, v. 405, p. 95-98, 1997.

Adaptação de um protocolo para extração do fluido de lavagem intercelular (FLI) de plantas de Vigna unguiculata.

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Adaptação de um protocolo para extração do fluido de lavagem intercelular (FLI) de plantas de Vigna unguiculata.

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