O objetivo desse trabalho foi identificar a existência de polimorfismos de conformação de cadeia simples (SSCP) e de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) em regiões do gene da leptina amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) de bovinos de corte pertencentes a três grupos genéticos terminados em confinamento.bitstream/CPAF-RO-2010/13292/1/cot336-leptina-bovina.pd

GIACHETTO, P. F.

SALMAN, A. K. D.

O objetivo desse trabalho foi identificar a existência de polimorfismos de conformação de cadeia simples (SSCP) e de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP) em regiões do gene da leptina amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) de bovinos de corte pertencentes a três grupos genéticos terminados em confinamento

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                                                           1 Zootecnista, D.Sc. em Zootecnia, pesquisadora da Embrapa Rondônia, Porto Velho, RO, aksalman@cpafro.embrapa.com.br 2 Zootecnista, D.Sc., pesquisadora da Embrapa Informática Agropecuária, Campinas, SP, poliana@cnptia.embrapa.br    Ana Karina Dias Salman1Poliana Fernanda Giachetto2Identificação de polimorfismos no  gene da leptina bovina 336ISSN 0103-9458 Dezembro, 2008 Porto Velho, RO A busca por marcadores moleculares para uso emseleção assistida em programas de melhoramentogenético baseia-se primariamente em análises depolimorfismos localizados em genes estruturaisresponsáveis por manifestações de características deherança poligênica.   O gene da leptina, também conhecido como gene daobesidade, é responsável pela síntese do hormônioleptina que está envolvido com os mecanismos queregulam a ingestão, o metabolismo energético, afisiologia reprodutiva e o sistema imunológico demamíferos (CHILLIARD et al., 2001). Por esse motivo,é considerado um gene candidato para associação comcaracterísticas quantitativas de interesse econômico,como por exemplo, deposição de gordura na carcaça,precocidade sexual, porcentagem de gordura no leite,produção de leite, entre outras.  O objetivo desse trabalho foi identificar a existênciade polimorfismos de conformação de cadeia simples(SSCP) e de tamanho de fragmentos de restrição(RFLP) em regiões do gene da leptina amplificadaspor reação em cadeia da polimerase (PCR) debovinos de corte pertencentes a três gruposgenéticos.  Os animais foram distribuídos em número de cinco porbaia,  em  galpão  experimental  construído  numa áreapertencente ao Departamento de MelhoramentoGenético e Nutrição Animal da Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia (FMVZ), UNESP-Botucatu (SP).  Amostras de 5,0 mL de sangue foram retiradas debezerros machos resultantes do cruzamento entrefêmeas Nelore e touros Angus (n=31), Simental(n=30) e Canchim (n=30) provenientes depropriedades particulares do interior do Estado de SãoPaulo. Em seguida, essas amostras foramhomogeneizadas por inversão e centrifugadas para aseparação da camada de leucócitos, a qual foi utilizadapara extração do DNA (MIRETTI, 1998). A precipitaçãodo DNA foi realizada em 2,0 mL de etanol absoluto, napresença de solução saturada de NaCl (6 M). Após aretirada do sal, por lavagem com 1 mL de etanol 70%,o DNA foi dissolvido em tampão Tris-EDTA (10:1) eestocado a 4 °C. As concentrações de DNA foramestimadas a partir da leitura em espectrofotômetro a260 nm (Beckman – DU 640 – Nucleic Acid andProtein Analyser) e a pureza verificada medindo-setambém a absorbância a 280 nm.  Os pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers)foram desenhados com base na seqüência do gene daleptina bovina depositada no Genbank (AC: U50365).As seqüências e as posições desses primers, com onome e o tamanho do fragmento amplificado, empares de bases (pb), são apresentadas na Tabela 1.   Identificação de polimorfismos no gene da leptina bovina  2Tabela 1. Seqüências e posições dos pares de iniciadores (primers) com os respectivos nomes e tamanhos, em pares de bases (pb), dos fragmentos do gene da leptina bovina (U50365) amplificados por PCR.  Nome do fragmento Seqüência dos iniciadores Posição Tamanho do fragmento (pb) Temperatura de associação dos primers LEPT 1 5’ -TTGCCTCCTGCCTTCTCACTC- 3’ 1402 644 67 ºC   5’ -CCTGGTGGCTCAGACGGTAAA- 3’ 2046  LEPT 2 5’-TCTTTACCGTCTGAGCCACCA- 3’ 2023 482 66 ºC  5’-GCCACCCACAGCAATCAATC- 3’ 2505  LEPT 3 5’-GGAAGGGCAGAAAGATAGGAGC- 3’ 2803 689 68 ºC  5’ –AGGAGGAGCGAGAGAGAAATGGC- 3’ 3492   As reações de amplificação foram realizadas para um volume final de 30 µL, contendo 160 ng de DNA, 0,75 µM de cada primer, tampão de PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH 9,0; 1,5 mM MgCl2 e 50 mM KCl), 250 µM de dNTP, 0,5 U de enzima Taq DNA polimerase, em termociclador. O programa de amplificação consistiu de um ciclo para desnaturação inicial a 96 ºC por 120 segundos, seguido de 35 ciclos para desnaturação a 96 ºC por 30 segundos, associação dos primers a X ºC por 80 segundos, e extensão a 72 ºC por 60 segundos, finalizando com um ciclo de 72ºC por 5 minutos, em que X variou de acordo com o par de primers utilizado (Tabela 1).   A análise de PCR-SSCP foi aplicada aos fragmentos LEPT 1 e LEPT3. Para tanto, alíquotas de 2 a 5 µL do fragmento amplificado por PCR foram diluídas, para um volume final de 10 µL, em tampão de corrida para SSCP. Em seguida, foram desnaturadas a 96 oC por 6 minutos, incubadas no gelo por igual intervalo de tempo, aplicadas em gel de poliacrilamida (acrilamida:bis-acrilamida 49:1) 15% sob condições não desnaturantes e submetidas à eletroforese (100 V) por 13 (LEPT 1), 15 (LEPT 2) e 20 (LEPT 3) horas. O fragmento       LEPT 7 foi separado em gel de poliacrilamida (acrilamida:bis-acrilamida 49:1) 10%, a 100V por 24 horas. Após a eletroforese, os géis foram corados com nitrato de prata para visualização das bandas.  A análise PCR-RFLP para detecção do polimorfismo descrito por Pomp et al. (1997) foi aplicada ao fragmento LEPT 2 utilizando a enzima de restrição Sau3AI.  Para tanto, utilizou-se 10 µL de amostra do fragmento amplificado por PCR, 1/10 do volume de tampão de reação e 3 U de enzima, para volume final de reação de 20 µL. Os produtos da digestão foram separados por eletroforese (100 V por 2 horas) em géis de agarose 1,8%, corados com brometo de etídeo, visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e fotografados para identificação dos tamanhos dos fragmentos resultantes, comparando-se com padrão de peso molecular de 100 pares de bases.   Na Fig. 1 está esquematizado o gene da leptina baseado na seqüência depositada no Genbank e nas informações de Taniguchi et al. (2002), com as posições dos exons e íntrons, bem como dos fragmentos amplificados e do sítio de restrição da enzima Sau3AI.                   Fig 1. Mapa do gene da leptina bovina baseado na seqüência depositada no Genbank (AC: U50365) e nas informações de Taniguchi et al. (2002), com as posições dos primers, os nomes dos fragmentos amplificados e o sítio da enzima de restrição Sau3AI (E=exon, I=íntron). 2046 I2  E2  E3 3’5’ 14022023 2505 LEPT1 LEPT2 Sau 3A I 2363 I1 2803 3492LEPT3 Identificação de polimorfismos no gene da leptina bovina 3As freqüências genotípicas foram estimadas conforme o procedimento descrito por Weir (1990). O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi verificado para o RFLP-Sau3AI pelo teste do Qui-quadrado (χ2).   Pela análise de PCR-RFLP verificou-se fragmentos de 340 e 142 pb que caracterizaram o alelo A. Um sítio adicional para a enzima Sau3AI na posição 2335 foi responsável pela digestão do fragmento de 340 pb em dois fragmentos de 312 pb e 28 pb (não visível no gel), os quais caracterizaram o alelo B. Na Tabela 2 são apresentadas as freqüências genotípica e alélica do RFLP no fragmento LEPT2 do gene da leptina dentro das populações estudadas, bem como os seus respectivos valores de χ2. Pode-se observar que as freqüências do alelo A e do genótipo homozigoto AA foram as maiores nas três populações estudadas. O grupo Simental x Nelore apresentou maior freqüência do genótipo heterozigoto (AB) e no grupo Canchim x Nelore não foi observado o genótipo homozigoto BB.   Tabela 2. Freqüências genotípica e alélica observadas em cada um dos grupos genéticos estudados com seus respectivos valores de Qui-quadrado calculados.  Grupo genético n Freqüência genotípica (%) Freqüência alélica (%) χ2 AA AB BB A B Angus x Nelore 31 84 13 3 90 10 0,15 Canchim x Nelore 30 87 13 0 93 7 2,12 Simental x Nelore 25 68 24 8 80 20 1,56 n = número de animais do grupo genético.  Como não houve diferença estatisticamente significativa (P>0,05) entre os valores do χ2 calculados para cada um dos grupos experimentais e o valor do χ2 tabelado, concluiu-se que as populações estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg.  O resultado da análise SSCP realizada com o fragmento LEPT1 demonstrou ausência de variação entre os animais dos três grupos genéticos. A Fig. 2 traz o resultado da análise de SSCP realizada no fragmento LEPT3, em que foi verificada a existência de três alelos (A, B e C) e cinco genótipos (AA, AB, CC e CB) nessa região do gene. Na Tabela 3 são apresentadas as freqüências genotípicas desses genótipos. Os genótipos AA e AB foram os mais freqüentes em todos os grupos experimentais. O genótipo CB não foi observado entre os animais Angus x Nelore e nem entre os Simental x Nelore, assim como o genótipo BB não foi observado no grupo Canchim x Nelore.                    Tabela 3. Freqüências dos genótipos SSCPs no fragmento LEPT3 do gene da leptina de novilhos pertencentes aos três grupos genéticos.  Genótipos Grupo genético Angus x Nelore Canchim x Nelore Simental x Nelore N % n % N % AB 6 20,7 5 17,9 11 40,7 AA 17 58,6 19 67,9 12 44,4 CC 5 17,2 2 7,1 2 7,4 BB 1 3,4 0 0,0 2 7,4 CB 0 0,0 2 7,1 0 0,0 Total 29 100 28 100 27 100  Para cada uma das populações estudadas, observou-se que os polimorfismos observados segregam independentemente (p<0,05) e, na ausência de desequilíbrio de ligação não foi possível estabelecer haplótipos predominantes nas populações.   O RFLP-Sau3AI já foi associado com características produtivas em rebanho leiteiro por Liefers et al. (2002), que avaliando uma população de 613 vacas leiteiras Holstein-Friesian, observaram aumento na produção de leite (P<0,05) e tendência de aumento na ingestão de matéria seca (P=0,087) e de peso vivo (P=0,077) das vacas heterozigotas AB quando comparadas às vacas do genótipo AA. Estudando esse mesmo polimorfismo em 145 machos da raça Holandesa, Oprzadek et al. (2003) encontraram relação significativa entre o genótipo AA e o consumo, o peso de carcaça e a deposição de gordura na carcaça.   Apesar das transições de citosina por timina na posição 1560 e de guanina por adenina na posição 1620 (considerando a seqüência U50365) terem sido descritas por Lien et al. (1997) e detectadas por Tessane et al. (1999) numa população de 137 bovinos  da  raça Angus, neste estudo não foram detectados SSCPs no fragmento LEPT1 que corresponde a essa mesma região dentro do íntron 2,  Fig. 2. Gel representativo do SSCP mostrando o padrão demigração das fitas simples de DNA do fragmento LEPT3 deanimais heterozigotos para os alelos A e B (AB), homozigotospara o alelo A (AA), homozigotos para o alelo C (CC),homozigotos para o alelo B (BB) e heterozigotos para os alelosB e C (CB). Identificação de polimorfismos no gene da leptina bovina  4o que indica a baixa variabilidade genética nessa região do gene da leptina entre os animais genotipados no presente estudo.  Considerações finais  O gene da leptina bovina apresenta polimorfismos do tipo RFLP e SSCP nas regiões do íntron 2 e do exon 3, respectivamente, em populações de bovinos resultantes do cruzamento entre fêmeas Nelore e touros Angus, Canchim e Simental. Tais polimorfismos podem ser avaliados em populações de bovinos de corte maiores visando à associação com características produtivas e reprodutivas.  Referências   CHILLIARD Y, BONNET M, DELAVAUD C, FAULCONNIER Y, LEROUX C, DJIANE J, BOCQUIER F. Leptin in ruminants. Gene expression in adipose tissue and mammary gland, and regulation of plasma concentration. Domestic Anim Endocrinol., v.21, n. 4, p.271-295,  nov. 2001  LIEFERS, S. C. ; TE PAS, M F. W. ; VEERKAMP, R. F. ; VAN DER LENDE, T. Associations between leptin gene polymorphisms and production, live weight, energy balance, feed intake, and fertility in holstein heifers. Journal of dairy science, v. 85, n.6, p. 1633-1638, 2002.                                          LIEN, S; SUNDVOLD, H; KLUNGLAND, H; VAGE, D I. Two novel polymorphisms in the bovine obesity gene (OBS). Animal genetics, v. 28, n. 3, p. 238-246, 1997.  MIRETTI, M.M.  Variabilidade genética no lócus BoLA-DRB3.2 de bovinos nativos e exóticos. Ribeirão Preto, 98p. Dissertação, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, 1998.  OPRZĄDEK, J.; FLISIKOWSKI, K.; ZWIERZCHOWSKI, L.; DYMNICKI, E. Polymorphisms at loci of leptin (LEP), Pit1 and STA-T5A and their association with growth, feed conversion and carcass quality in Black-and-White bulls. Animal Science Papers and Reports, v. 21, n. 3, p.135-145, 2003.  POMP, D.; ZOU, T.; CLUTTER, A. C.; BARENDSE, W. Rapid communication: Mapping of leptin to bovine chromosome 4 by linkage analysis of a PCR-based polymorphism. J. Anim. Sci., v. 75, p. 1427, 1997.  TANIGUCHI, Y. ; ITOH, T. ; YAMADA, T. ; SASAKI, Y. Genomic structure and promoter analysis of the bovine leptin gene. IUBMB Life, v. 53, n. 2, p. 131-135, 2002.  TESSANNE, K. ; HINES, H. C.; DAVIS, M. E. Relationships of  polymorphisms in the bovine leptin gene with differences in beef carcass traits. Columbus: The Ohio State University, 1999. (Research and Reviews: Beef and Sheep. Special Circular, 170). Disponível em: <http://ohioline.osu.edu/sc170/sc170_6.html>. Acesso em: 10 Maio 2007.  WEIR, B.S. Genetic data analysis: methods for discrete population genetic data. Massachussets: Sinauer Associates, 1990, 377 p.                               Expediente Normalização: Daniela Maciel Revisão de texto: Wilma Inês de França Araújo Editoração eletrônica: Marly de Souza Medeiros Comitê dePublicaçõesPresidente: Cléberson de Freitas Fernandes Secretária: Marly de Souza Medeiros Membros: Abadio Hermes Vieira André Rostand Ramalho Luciana Gatto Brito Michelliny de Matos Bentes-Gama Vânia Beatriz Vasconcelos de Oliveira  Exemplares desta edição podem ser adquiridos na: Embrapa Rondônia  BR 364 km 5,5, Caixa Postal 406, CEP 78900-970, Porto velho, RO. Fone: (69)3901-2510, 3225-9387 Telefax: (69)3222-0409 www.cpafro.embrapa.br  1ª edição 1ª impressão (2008): 100 exemplares ComunicadoTécnico, 336

Identificação de polimorfismos no gene da leptina bovina.

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