ANTHONISEN, D. G.

ANTHONISEN, E. F.

CASAGRANDE JR. J. G.

MILANI, M.

SCHIRMER, M. A.

SILVA, S. D. dos A.

Infoteca-e

ISSN 1806-9185Dezembro, 2006Pelotas, RSComunicadoTécnicoDenilson Gouvêa Anthonisen1Manoel Artigas Schirmer2Eliane Freire Anthonisen3Sérgio Delmar dos Anjos Silva4Máira Milani5João Guilherme Casagrande Jr.61531Bacharel em química, analista da Embrapa Clima Temperado, mestrando do Departamento de Ciência eTecnologia Agroindustrial, DCTA, da Universidade Federal de Pelotas, UFPEL, (denilson@cpact.embrapa.br)2Quím., Dr., Prof. da Universidade Federal de Pelotas, (schirmer@ufpel.edu.br)3Graduanda do curso de bacharelado em química da Universidade Federal de Pelotas,(eliane.f.a@ibest.com.br)4Eng. Agrôn., Dr.,.pesquisador da Embrapa Clima Temperado (sergio@cpact.embrapa.br)5Eng. Agrôn., MSc., pesquisadora da Embrapa Algodão, (maira@cnpa.embrapa.br)6Eng. Agrôn., Dr., bolsista de pós-doutorado da Fundação de Apoio à Pesquisa Edmundo Gastal, FAPEG,(jgcasa@uol.com.br)Validação da espectroscopiade ressonância magnéticanuclear (RMN) nadeterminação do teor deóleo em sementes demamonaIntroduçãoDevido ao elevado valor comercialdos óleos vegetais, a produção emescala industrial não podeprescindir da extração porsolvente, pois na prensagemmecânica, mesmo sob altapressão, em torno de 5% do óleocontido no material extraído ficamretidos na torta, teores que podemser reduzidos a 0,5%, quandosolventes orgânicos são utilizados(MORETTO; FETT, 1998). SegundoChristie (1993), vários solventes oucombinações deles são usuaisextratores de óleo (Tabela 1).Hoseney (1991) atribui talpropriedade à variedade e àcomplexidade das substâncias quea denominação óleo abrange,desde ácidos graxos livres atélipoproteínas. O autor destaca, porexemplo, que lipídios não polares,como ácidos graxos livres etriglicerídios, compõem a fraçãosolúvel em clorofórmio, enquantoos polares, como fosfolipídios eglicolipídios, dissolvem-se emmetanol. O hexano é o solventeorgânico preferido no processo deextração, por ser o mais seletivo,possuir estreita faixa de ebulição eser imiscível com a água (Tabela 1),2Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamonaTabela 1. Detalhes técnicos de métodos de extração de óleo.1Citado por Moretto e Fett (1998); 2Citado por Paquot (1979); 3Citado por Pregnolatto ePregnolatto (1985); 4Citado por Vicenzi (2004).Para Colnago (1996), laboratóriospodem dispensar a extração porsolvente para a determinaçãorotineira do teor de óleo,especialmente quando grandesquantidades de amostras precisamser avaliadas, por se tratar de umprocesso demorado e destrutivo.De acordo com o autor, aressonância magnética nuclearo que evita misturas azeotrópicas(MORETTO; FETT, 1998). Noentanto, sua inflamabilidade, custoe potencial poluidor, justificam oestudo de alternativas ao seu uso.Para trabalhos em escalalaboratorial, Mendham et al. (2002)afirmam que a escolha da técnicaanalítica, além de segurança ecusto, deve considerar outroscritérios, como o tempo deexecução do ensaio, o volume detestes que serão realizados, anatureza e a quantidade deamostra. Segundo os autores,métodos destrutivos, cujoprocesso de preparo de amostrasou a própria determinaçãoenvolvem a dissolução e/oufragmentação do material emestudo, implicam, portanto, emtransformação da matriz paramelhorar a detecção do analito.Isto consome tempo, exigeinvestimento e gera fonte de erros,como a diluição. Os autoresafirmam, ainda, que métodosinstrumentais, baseados empropriedades físicas, comoabsorção ou emissão de energia,condutividade elétrica, rotaçãoóptica, são capazes de fornecerinformações quantitativas de umanalito, preservando ascaracterísticas das amostras egerando resultado.3Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamona(RMN) é um método alternativopara a determinação do teor deóleo e apresenta vantagens comoa rapidez, a preservação da matriz,simplicidade no preparo daamostra e a possibilidade de usode sistemas in vivo para adeterminação.A espectroscopia de ressonânciamagnética nuclear (RMN) mede aabsorção de radiaçãoeletromagnética de até 750MHzpelos núcleos dos átomos,presentes na amostra. O uso datécnica no estado sólido é umcampo especializado que abrangedesde o estudo de polímeros até aprodução de imagens (MENDHAMet al., 2002).Analisar uma mesma amostrausando diferentes técnicas podeservir para verificar a ordem degrandeza de um resultado ou paraconfirmar a existência de umanalito, obtido pela técnica original.Comparar resultados é uma práticacomum à química analítica paraverificar a precisão de técnicasdistintas e determinar se conjuntosdiferentes de dados são coerentese, portanto, confiáveis (LEITE,1998). Além disso, Ellison et al.(2002) destacam que a atualpreferência pelos métodosanalíticos oficiais, para adeterminação dos mais variadosanalitos, tem origem nanecessidade de apresentar dadoscom rastreabilidade e precisão.Contudo, a exigência formal deconfiabilidade consiste narastreabilidade do resultado a umareferência que pode serrepresentada por métodoreconhecido ou empírico (ELLISONet al.., 2002). O uso daespectroscopia de RMN pressupõe,portanto, a necessidade deestabelecer previamente umareferência para os resultados,como forma de validá-los.Validar um ensaio laboratorial écomprovar, através de evidênciaobjetiva, que os requisitos para suaaplicação foram atendidos(INMETRO, 2005). Embora avalidação não tenha sidoformalmente definida, o foco incidesobre a confiabilidade analítica dométodo, sem desprezar o critériopessoal, quando o interessadopromove adaptações e ajusta asrecomendações técnicas às suasnecessidades (LEITE, 1998).Leite (1998) destaca que avalidação deve ser um processoabrangente que avalie desde aestrutura suporte e o ambientelaboratorial até a capacitação doanalista. Neste contexto, deve-seter especial interesse emparâmetros básicos, comoexatidão, precisão, segurança,calibração, respostas analíticas eavaliação estatística.Entendendo a necessidade deagilidade na geração de resultados,preservação de amostras, reduçãode riscos operacionais eminimização do impacto ambiental,mas, sobretudo, reconhecendo serimprescindível a confiabilidade dosresultados gerados em análiseslaboratoriais, este trabalho objetivaa validação da técnica dedeterminação do teor de óleo desementes de mamona, usando aespectroscopia de ressonânciamagnética nuclear.4Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamonaEspectroscopia de RessonânciaMagnética Nuclear (RMN)A determinação do teor de óleo emsementes de mamona, utilizando-se a técnica de RMN, foi conduzidaa partir de procedimentos descritospor Colnago (1996), na EmbrapaAlgodão, em três repetições. Aprimeira etapa desta técnica foi acalibração do espectrômetro deonda contínua de 2,7MHz, usando-se farinha e óleo de mamona,como os pontos zero e 100%,respectivamente. Uma vezrealizada a calibração, procedeu-seà determinação do teor de óleo dasamostras. Ao final da leitura, opeso de amostra usado no teste foiinserido no sistema e o teor deóleo fornecido automaticamente.Método de Extração SoxhletA determinação do teor de óleo emsementes de mamona utilizando-seo método Soxhlet com hexano foirealizada, em três repetições, combase nos procedimentos definidospela IUPAC (PAQUOT, 1979). A fimde se obter a maior fração deextrato possível (produto de pesoconstante), foram adotados 40refluxos, totalizando cerca de trêshoras e trinta minutos de extração,desde o primeiro refluxo. Ao finalda extração, o solvente foirecuperado e o teor de lipídios foideterminado pela relaçãogravimétrica percentual entre oóleo obtido e as sementessubmetidas à extração.Tabela 2. Procedência das cultivares comerciais de mamona cultivadasem Pelotas, RS, na safra 2005-2006. Embrapa Clima Temperado, 2007.Material e métodosO processo de validação da técnicade espectroscopia de RMN passapelas etapas de definição daprecisão e da exatidão dosresultados, neste caso pelacomparação com o método deextração do tipo Soxhlet, usandohexano como solvente, por ser ométodo oficial de determinação doteor de óleo, de acordo com aIUPAC, International Union of Pureand Applied Chemistry.Sementes de mamonaAs sementes utilizadas navalidação da técnica deespectroscopia de RMN foramobtidas de cinco cultivarescomerciais de mamona cultivadasna Embrapa Clima Temperado, emPelotas/RS, na safra 2005-2006(Tabela 2).5Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamonaTabela 3. Teor médio de óleo (% p/p base seca) em sementes decultivares comerciais de mamona cultivadas pela Embrapa ClimaTemperado em Pelotas/RS, na safra 2005-2006, determinado pelo métodode extração Soxhlet usando hexano e pela técnica de RessonânciaMagnética Nuclear (RMN). Embrapa Clima Temperado, 2007.Avaliação estatística dos dadosA medida da precisão da técnicainstrumental baseou-se naavaliação da variância dosresultados obtidos para cadacultivar testada. Para fazê-lo, foramcomparados os dois conjuntos dedados pelo teste F. A exatidão foimedida através da comparação demédias (teste t) dos dados, obtidaspela espectroscopia de RMN e pelométodo clássico de extração(Soxhlet) de óleo das sementes.Resultados e DiscussãoA determinação do teor de óleo emsementes de mamona pelo métodoSoxhlet de extração por solventeorgânico, usando hexano, forneceuos resultados reunidos na Tabela 3,considerados referência navalidação da técnica instrumental(RMN). Os valores de desviopadrão entre 0,34 e 0,51, além decoeficientes de variação queoscilaram entre 0,77 e 1,17%indicam precisão elevada, requisitointrínseco a um método analíticooficial.A técnica instrumental deespectroscopia de ressonânciamagnética nuclear (RMN) gerouvalores de desvio padrão queoscilaram entre 1,39 e 2,04, ecoeficientes de variação, entre 3,21e 4,24% (Tabela 3), que indicammenor precisão, quandocomparada ao método clássico(Soxhlet). Entretanto, a avaliaçãodos resultados da análise devariância através do teste F permiteverificar que não existe diferençasignificativa em um nível deconfiança de 5%.Ao avaliar a exatidão da técnicaproposta, usando-se o teste t paracomparação das médias, percebe-se que também não há diferençasignificativa entre os valores emnível de confiança de 1%, conformedados expostos na Tabela 4.Embora seja possível observar queos valores absolutos obtidos com ouso da técnica de espectroscopia6Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamonaTabela 4. Dados da avaliação estatística da precisão e da exatidão datécnica de espectroscopia de RMN para a determinação do teor de óleo(% p/p b.s.) em sementes de cultivares comerciais de mamona, usandocomo referência o método Soxhlet. Embrapa Clima Temperado, 2007.de RMN foram ligeiramentesuperiores, os coeficientes decorrelação, ao redor de 1, indicamque os teores de óleo de cadacultivar, em ambas as técnicasanalíticas, são equivalentes,ratificando a informação geradapelo teste t.A classificação dascultivares, segundo o teor de óleo,obtida a partir dos resultados deambas as técnicas analíticas, foiequivalente. O híbrido Íris é omaterial de maior teor, 47,9 e 49,1%,no método Soxhlet e naespectroscopia de RMN,respectivamente. As variedadesVINEMA-T1 e Cafelista,apresentaram os menores teoresentre os materiais avaliados e,embora os valores absolutos deteor de óleo para a variedade IAC-226 e para o híbrido Savanaindiquem alternância de posiçãocomo segunda e terceira cultivarcom maior teor de óleo, taisresultados não diferemestatisticamente em um nível designificância de 5%.ConclusõesO uso da espectroscopia deressonância magnética nuclear(RMN) permite determinar, comprecisão, o teor de óleo emsementes de mamona.A espectroscopia de RMN e ométodo oficial, de extração tipoSoxhlet com hexano, produzemresultados equivalentes nadeterminação do teor de óleo emsementes de mamona.Onde:s2 é a variância;F é o valor de F, obtido pela razão entre as variâncias de cada técnica de determinação;F5%= 19,00 é valor tabelado para ± = 0,05;t é valor t obtido da comparação das médias;t1%= 3,75 é valor tabelado para ± = 0,01.7Validação da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) na determinação do teor de óleo emsementes de mamonaAgradecimentosOs autores agradecem aoMinistério do DesenvolvimentoAgrário (MDA), ao Centro Federalde Educação Tecnológica dePelotas (CEFET/RS) e à EmbrapaAlgodão (CNPA), pelo apoio narealização deste trabalho.ReferênciasCHRISTIE, W.W. Advances in LipidMethodology. Dundee: Oil Press,1993. p. 195-213.COLNAGO, L.A. Análise do teorde óleo em sementes por RMN.São Carlos: EmbrapaInstrumentação Agropecuária,1996. 13 p. (EmbrapaInstrumentação Agropecuária.Circular técnica, 3).ELLISON, S.L.R.; ROSSLEIN, M.;WILLIAMS, A. Guia EURACHEM/CITAC: determinando a incertezana medição analítica. 2 ed. Rio deJaneiro: Sociedade Brasileira deMetrologia, 2002. 166 p.HOSENEY, R.C. Principios deciencia y tecnología de loscereales. Zaragoza: Acribia, 1991.317 p.INMETRO. Orientações paraseleção e uso de materiais dereferência: DQO-CGCRE-016.Revisão 00. Rio de Janeiro:INMETRO-DICLA, 2005. 15 p.LEITE, F. Validação em análisequímica. 3 ed. Campinas: Átomo,1998. 224 p.MENDHAM, J.; DENNEY, R.C.;BARNES, J.D.; THOMAS, M. Vogel:análise química quantitativa. 6. ed.Rio de Janeiro: LTC, 2002. 462 p.MORETTO, E.; FETT, R. Tecnologiade óleos e gorduras vegetais naindústria de alimentos. SãoPaulo: Livraria Varella, 1998. 151 p.PAQUOT, C. 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Lopes GarciaMembros: Cláudio Alberto Souza da Silva, LígiaMargareth Cantarelli Pegoraro, Isabel HelenaVernetti Azambuja, Luís Antônio Suita de Castro.Suplentes: Daniela Lopes Leite e Luís EduardoCorrêa AntunesRevisão de texto: Sadi SapperNormalização bibliográfica: Regina das GraçasVasconcelos dos SantosEditoração eletrônica: Oscar CastroComunicadoTécnico, 153Comitê depublicaçõesExpediente

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