MACHADO, C. A. E.

REVERS, L. F.

Infoteca-e

ISSN 1808-6802Dezembro, 2005Bento Gonçalves, RS                  Comunicado 64                  TécnicoIdentificação varietal egenotipagem – serviços oferecidospelo Laboratório de BiologiaMolecular da Embrapa Uva e VinhoLuis Fernando Revers1Carlos Alberto Ely Machado1                                     1 Embrapa Uva e Vinho, Caixa Postal 130, CEP 95700-000 Bento Gonçalves, SP, Brasil. E-mail:luis@cnpuv.embrapa.br; carlos@cnpuv.embrapa.br.IntroduçãoA identificação de cultivares de uva étradicionalmente baseada na ampelografia,através da análise e comparação decaracterísticas morfológicas de folhas, tipo debrotos, cachos e tipo de baga (GALET, 1991;BOURSIQUOT; THIS, 1996; IPGRI, 1997;GALET, 2000). No entanto, a perícia emampelografia é restrita a um número pequeno ecada vez menor de especialistas. Além disso, aexpressão das características morfológicas éinfluenciada por fatores ambientais, biologia,histórico da planta; e plantas jovens sãopraticamente impossíveis de se identificar,porque com 4 ou 5 anos, ainda não exibemcaracterísticas morfológicas típicas de plantasadultas.Algumas cultivares geneticamente próximas sãomorfologicamente muito similares e difíceis dediferenciar mediante comparação botânica(ARADHYA et al., 2003). Por outro lado, clonesintravarietais podem diferir consideravelmenteno fenótipo, mesmo que tenham perfis de DNApraticamente idênticos (VIGNANI et al., 1996;FRANKS et al., 2002; RIAZ et al., 2002). Parasuperar estas limitações da ampelografia,marcadores moleculares baseados em DNA têmsido utilizados para diferenciar, caracterizar eidentificar as cultivares de videira existentesmais cultivadas. Os marcadores moleculares dotipo microssatélite, também conhecidos comoSSR (Simple Sequence Repeat), sãomarcadores moleculares baseados naamplificação de seqüências repetidas (1 a 6pares de base) originalmente desenvolvidospara marcação do genoma humano (LITT;LUTY, 1989; WEBER; MAY, 1989), masabundantemente encontrados no genoma deeucariotos (LAGERCRANTZ et al. 1993;WANG et al. 1994). Devido à distribuiçãoregular no genoma de eucariotos,multialelismo (alto nível de polimorfismo),padrão de segregação codominante ereprodutibilidade, este tipo de marcadortornou-se amplamente utilizado e adequadopara muitas aplicações genéticas. Entre elasdestacam-se os testes de identidadegenética, onde há necessidade dediscriminação de indivíduos e identificaçãode parentesco, além de serem utilizados nostrabalhos de mapeamento genético (SEFC etal., 2001).A utilização de marcadores microsatélitespara a construção de bancos de dados eidentificação de cultivares de videira podesimplificar a identificação de erros esinonímias no vasto número de cultivaresutilizado na viticultura brasileira. As principaisaplicações da metodologia estão naidentificação precisa de cultivares de videira,recuperação de genealogias e genotipagemde novas cultivares (proteção intelectual).Conseqüentemente, estas práticas podemtambém ser utilizadas em procedimentosmodernos de controle nas cadeias produtivascomo: rastreabilidade, certificação de mudaspor viveristas e de vinhedos visando atenderrequisitos de denominações de origem eindicações de procedência controladas.O serviço de identificação varietal da EmbrapaUva e Vinho utiliza um banco de dadosespecializado, denominado BanVitis,desenvolvido no Laboratório de BiologiaMolecular Vegetal (LBMV) contendo mais de2.000 perfis genético-moleculares compiladosde coleções de dados de videira internacionais(França, Itália, Estados Unidos, Grécia etc.), daliteratura internacional especializada sobrevideira e gerados pelas atividades de pesquisado LBMV. Cultivares de videira podem seridentificadas comparando-se o perfil de testesde DNA de uma amostra desconhecida devideira com perfis conhecidos no banco dedados. A identificação pode ser realizada paracultivares de uva viníferas, cultivares de uvas demesa, cultivares híbridas, cultivares de uvaamericanas e porta-enxertos (este último emmenor número).Descrição dos serviçosIdentificação genética (DNA) decultivares de videiraEste teste é utilizado para determinar ouconfirmar a identidade de uma amostraparticular de videira. Para este propósito, aamostra da videira em questão será testadautilizando-se um número cientificamenterelevante de marcadores microssatélites (SSR -Simple Sequence Repeats), e o perfil do testede DNA resultante é comparado com um bancode dados de cultivares conhecido, permitindo aidentificação da cultivar correspondente àamostra testada. Neste teste, serão utilizadoscomo padrão, seis loci de marcadoresmicrossatélites suficientemente capazesdistinguir um número elevado de cultivares devideira (VVMD5, VVMD7, VVMD27, VVS2,VrZAG 62 e VrZAG79, This et al. 2004).Adicionalmente, conforme avaliação caso acaso, 3 a 4 loci de marcadores SSR adicionaispoderão ser utilizados, visando elevar o grau deconfiabilidade do teste. Padrões de perfisgenéticos previamente conhecidos serãoutilizados como referência para a realização doteste de identificação genética. A Figura 1mostra um exemplo de teste de identificaçãogenética realizado. Neste exemplo o produtorpossuía dúvidas se a cultivar de seus vinhedoscorrespondia à cultivar Carménère ou àCabernet Franc.  Após a realização do teste, aestimativa da probabilidade de identidadecalculada da amostra da cultivar fornecida aoLBMV ser idêntica à cultivar Carménère dobanco ativo de germoplasma da Embrapa Uva eVinho foi de 99,99986%, permitindo aidentificação precisa da cultivar correspodente àamostra fornecida.Limitações relacionadas com oteste de DNA para identificação devideiras  Apesar do banco de referência de dados daEmbrapa Uva e Vinho ser bastante completoe de ser possível o acesso aos bancos dedados e à literatura internacionais, estasbases de dados não possuem todas ascultivares conhecidas.  Não existindo perfilgenético-molecular de referência paracomparação com a amostra submetida, nãoserá possível realizar a identificação.  A tecnologia utilizada não tem o poder dedistinguir variantes de uma cultivar de videira.Perfis genético-moleculares de variantesreferidas comumente como mutaçõessomáticas, propagadas de forma clonal,serão idênticos, apesar das diferençasobservadas na planta e frutos seremsignificantes.  Designações numéricas utilizadas paradefinir o tamanho dos alelos demicrossatélites podem diferir sensivelmenteentre laboratórios devido à diferençasmetodológicas. Ajustamentos paradiferenças observadas entre laboratóriospoderão ser realizadas referenciando-secultivares comuns que possuam os mesmosalelos dos das amostras analisadas.  Genótipos ambíguos para um determinadomarcador SSR podem ser observadosocasionalmente. Estas ambigüidades,conseqüência normal da metodologia, podemser solucionadas se os genitores da cultivarforem incluídos nas análises. Estasambigüidades não constituem um problemana geração de um perfil único para a cultivartestada, uma vez que os resultados paraoutros marcadores SSR são geralmentecorretos, e estes podem sozinhoscaracterizar uma cultivar de videiraunicamente.Genotipagem de novas cultivaresde videiraEsta caracterização é utilizada para criar umperfil genético-molecular característico(assinatura molecular) de uma cultivar devideira para proteção intelectual. Para estepropósito, duas amostras separadas de umacultivar são genotipadas para um númerocientificamente relevante de marcadoresmicrossatélites (SSR) e uma assinaturagenético-molecular única é gerada. De 10-12marcadores SSR serão utilizados, umnúmero suficiente para identificar unicamentequalquer cultivar de videira com grau deconfiabilidade extremamente alto. O processo érealizado duas vezes para cada cultivar antes daemissão do laudo técnico. A Tabela 1 mostra aassinatura genético molecular obtida para acultivar BRS Linda, comparada com o perfilgenético de uma cultivar tradicional de uva semsementes (Superior Seedless). Este perfilgenético molecular foi anexado como descritormolecular ao processo de registro da cultivar noMinistério da Agricultura.Laudo TécnicoTodos os testes são realizados por pessoaltécnico qualificado seguindo os conceitos deboas práticas laboratoriais e os resultados sãorevisados pela equipe do LBMV antes daemissão do laudo técnico.  O laudo técnico a seremitido por ocasião da finalização do teste deDNA descreverá em detalhes os procedimentosrealizados, expressando a probabilidade deidentidade da amostra fornecida com amostraspadrão.  As estimativas de probabildade deidentidade genética são obtidas explorando asfrequências de distribuição alélicas conformedescrito por Paetkau et al. (1995), utilizando-seo software Identity (WAGNER; SEFC, 1999). Oprograma Identity foi originalmente desenvolvidopor Wagner e Sefc (1999) para realização deestudos com dados de microssatélites eidentificação de sinonímias no gerenciamentode bancos de germoplasma de videira.Utilizando este princípio, o programa procuranos perfis de dados de microssatélitesfornecidos por genótipos idênticos, permitindo-se então, identificar-se cultivares iguais.Coleta, preparo e fornecimento deamostrasAs melhores amostras para fazer o teste deDNA correspondem à folhas jovens coletadasde brotos em crescimento, embora outrostecidos possam também ser utilizados, incluindofolhas adultas verdes, raízes, frutos e estacascontendo gemas dormentes (30 a 40cm). Parapreservar o DNA e assegurar a estabilidade daamostra, as mesmas devem permanecerresfriadas e levemente umidecidas, porém nãoem contato direto com gelo. Quando possível,coletar ramos contendo de 4-5 folhas jovens (4a 8 cm de diâmetro), proteger com papelalumínio, acondicionar em sacos plásticoslimpos e transportar em caixa de isoporcontendo gelo.  Juntamente com o fornecimentodas amostras o usuário dos serviços deveráinformar o nome das cultivares que podemcorresponder à amostra fornecida, procedência,o porta-enxerto utilizado e endereço paracontato (contendo telefone e e-mail). Formade submissão: a amostra deverá serentregue (preferencialmente) no setor derecebimento de amostras da Embrapa Uva eVinho.Acordo para provisão de serviçosde identificação baseados emtestes de DNAPara utilizar o serviço de identificação varietalde videiras utilizando testes baseados emmarcadores de DNA, deverá ser realizadoum acordo entre o usuário e a Embrapa Uvae Vinho, no qual será discriminado o tipo doserviço a ser realizado, além de conter aidentificação e o número de amostrassubmetidas (o formulário está disponível nosetor de recebimento de amostras daEmbrapa Uva e Vinho). Em virtude do custode elevado, o serviço somente será iniciadoapós concordância de ambas as partes. Oscustos dos serviços, tempo para execução eliberação de resultados podem serconsultados diretamente no setor derecebimento de amostras da Embrapa Uva eVinho.Referências BibliográficasARADHYAM, K.; DANGL, G. S.; PRINS, B.H.; BOURSIQUOT, J. M.; WALKER, A. M.;MEREDITH, C. P.; SIMON, C. J. Geneticstructure and differentiation in cultivatedgrape Vitis vinifera L.  Genetical Research,Cambridge, v. 81, n. 3, p. 179-192, 2003.BOURSIQUOT, J. M.; THIS, P.  Lesnouvelles techniques utilisees enampélographie: informatique et marquage.Journal Internacional des Sciences de laVigne et du Vin, Bordeaux, v. 30, p.13-23,1996. Número especial. La viticulture à l’aubedu IIIéme Millénaire.FRANKS, T.; BOTTA, R.; THOMAS, M. R.;FRANKS, J. Chimerism in grapevines:implication for cultivar identity, ancestry andgenetic improvement.  Theoretical andApplied Genetics, Heidelberg, v. 104, n. 2-3,p. 192-199, 2002.GALET, P. Précis d’ampelographiepratique. 6. éd.  Montpellier: Dehan, 1991.256 p.________. Dictionnaire encyclopédiquedes cépages. Paris: Hachette, 2000. 1024 p.IPGRI. Descripteurs de la vigne (Vitis spp.).Roma: IPGRI: UPOV: OIV, 1997. 62 p.LAGERCRANTZ, U.; ELLEGREN, H.;ANDERSSON, L.  The Abundance of VariousPolymorphic Microsatellite Motifs DiffersBetween Plants and Vertebrates.  Nucleic AcidsResearch, v. 21, n. 5, p. 1111-1115, 1993.LITT, M.; LUTY, J. A. A HypervariableMicrosatellite Revealed by Invitro Amplification ofA Dinucleotide Repeat Within the Cardiac-Muscle Actin Gene.  American Journal ofHuman Genetics, v. 44, n. 3, p. 397-401, 1989.PAETKAU, D.; CALVERT, W.; STIRLING, I.;STROBECK, C. Microsatellite analysis ofpopulation structure in Canadian polar bears.Molecular Ecology, Edmonton, v. 4, n. 3, p.347-354, 1995.RIAZ, S.; DANGL, G. S.; EDWARDS, K. J.;MEREDITH, C. P. Genetic divergence andchimerism within ancient asexually propagatedwinegrape cultivars.  Journal of the AmericanSociety for Horticultural Science, MountVernom, v. 127, n. 4, p. 508-514, 2002.SEFC, K. M.; LEFORT, F.; GRANDO, M. S.;SCOTT, K. D.; STEINKELLNER, H.; THOMAS,M. R. Microsatellite markers for grapevine: astate of the art. In: ROUBELAKIS-ANGELAKIS,K. A. (Ed.). Molecular biology andbiotechnology of grapevine.  Amsterdam:Kluwer, p. 433-463, 2001.THIS, P.; JUNG, A.; BOCCACCI, P.;BORREGO, J.; BOTTA. R.; COSTANTINI, L.;CRESPAN, M.; DANGL, G. S.; EISENHELD,C.; FERREIRA-MONTEIRO, F.; GRANDO,S.; IBÁÑEZ, J.; LACOMBE, T.; LAUCOU, V.;MAGALHÃES, R.; MEREDITH, C.; MILANI,N.; PETERLUNGER, E.; REGNER, F.;ZULINI, L.; MAUL, E. Development of astandard set of microsatellite referencealleles for identification of grape cultivars.Theoretical and Applied Genetics,Heidelberg, v. 109, p. 1448-1458, 2004.VIGNANI, R.; BOWERS, J. E.; MEREDITH,C. P.  Microsatellite DNA polymorphismanalysis of clones of Vitis viniferaSangiovese’.  Scientia horticulturae,Amsterdam, v. 65, n. 2-3, p. 163-169, 1996.WAGNER, H. W.; SEFC, K. M.  IDENTITY,1.0.  Wienn: Centre for Applied Genetics,University of Agricultural Sciences, 1999.WANG, Z.; WEBER, J. L.; ZHONG, G.;TANKSLEY, S. D.  Survey of Plant ShortTandem Dna Repeats.  Theoretical andApplied Genetics , v. 88, n. 1, p. 1-6, 1994.WEBER, J. L.; MAY, P. E.  Abundant Classof Human Dna Polymorphisms Which Can beTyped Using the Polymerase Chain-Reaction.American Journal of Human Genetics, v.44, n. 3, p. 388-396, 1989.Fig. 1.  Comparação de 4 loci de microssatélites, com padrão de amplificação distintos para a amostra fornecidapelo cliente (?), cultivar Cabernet Franc (CF), Merlot (Me) e cultivar Carménère (Ca).  Os retângulos identificam operfil de DNA idêntico entre (?) e (Ca), resultando na identificação da cultivar desconhecida (?) como Carménère(ca).Tabela 1. Perfil genético molecular de alelos amplificados (em pares de base) para a cultivar BRS Lindacomparando-se coma cultivar morfologicamente semelhante Superior Seedless, utilizando 15 loci demarcadores microssatélites.Locus SSRBRS LindaAlelos em pares de baseSuperior Seedless*Alelos em pares de baseVVMD5 234 236 236 226VVMD21 245 245 nd ndVVMD25 250 256 259 257VVMD27 194 194 181 181VVMD32 270 270 279 258VVMD36 240 250 nd ndVVS1 180 180 nd ndVRZAG64 140 140 nd ndVVMD6 210 210 210 210VVMD7 238 250 248 238VVS29 270 270 177 169VRZAG62 188 197 nd ndVRZAG79 249 257 nd ndVRZAG93 189 195 nd ndVRZAG112 231 242 nd ndNd  = alelos não determinados.• Os dados para os alelos correspondentes aos loci VVMD5, VVMD25 e VVMD27 da cultivar Superior foramobtidos junto ao Centro Regional de Ivestigación La Platina (INIA), Santiago, Chile.ComunicadoTécnico, 64Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Uva e VinhoRua Livramento, 515 – Caixa Postal 13095700-000  Bento Gonçalves, RSFone: (0xx)54 3455-8000Fax: (0xx)54 4451-2792http:// www.cnpuv.embrapa.br1ª edição1ª impressão (2005): on-lineComitê dePublicaçõesExpedientePresidente: Lucas da Ressurreição GarridoSecretária-Executivo: Sandra de Souza SebbenMembros: Jair Costa Nachtigal, Kátia Midori Hiwatashi,Osmar Nickel, Viviane Maria Zanella Bello FialhoRevisão do texto: Kátia Midori HiwatashiNormatização bibliográfica: Kátia Midori HiwatashiCGPE 5533

Identificação varietal e genotipagem: serviços oferecidos pelo Laboratório de Biologia Molecular da Embrapa Uva e Vinho.

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