BELICUAS, S. N. J.

GUIMARAES, C. T.

MAGALHAES, J. V. de

Infoteca-e

177ISSN 0102-0099Dezembro, 2009Sete Lagoas, MGMinistério da Agricultura Pecuária e Abastecimento Caracterização Molecularde Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaSílvia Neto Jardim Belicuas Claudia Teixeira Guimarães Jurandir Vieira Magalhães 123A variabilidade genética é um dos mais amostragem do genoma. Têm sido empregados importantes recursos na natureza e sua para a seleção assistida (ABALO et al., 2009) disponibilidade, emprego e conservação são fingerprintings com fins de investigação de estratégicos para a agricultura. O milho e o pureza e proteção de cultivares (WARBURTON sorgo são culturas empregadas em todo o et al., 2002) e avaliação de diversidade (KLEIN mundo para alimentação humana e animal e et al., 2008; LU et al., 2009). A genotipagem das para a produção de biocombustíveis, sendo linhagens elite permite, além da proteção de espécies de enorme importância econômica. cultivares, o direcionamento dos cruzamentos entre linhagens geneticamente distantes, O profundo conhecimento do material elite de favorecendo a obtenção de híbridos mais um programa de melhoramento é indispensável vigorosos e de alta produtividade. Quando as para sua exploração sistemática, tornando informações genotípicas e fenotípicas de possível o desenvolvimento de novas linhagens linhagens-elite encontram-se adequadamente e híbridos. O conhecimento desse material pode integradas, é possível que o melhorista ser empregado para atribuição do mesmo em selecione parentais que, ao serem cruzados, grupos heteróticos, escolha de testadores para gerem populações enriquecidas para ensaios de combinações híbridas e para a combinações desejáveis de alelos favoráveis geração de híbridos (WENZEL, 2006). (GUIMARÃES et al., 2009). Um dos maiores desafios da biotecnologia na Os marcadores microssatélites oferecem agricultura tem sido acelerar etapas dentro do vantagens em termos de confiabilidade, programa de melhoramento. Para isso, os reprodutibilidade, discriminação, padronização e marcadores moleculares podem ser custo sobre outros tipos de marcadores empregados, pois permitem uma ampla 1Bióloga, doutora, Pesquisadora A - Embrapa Milho e Sorgo - silvia@cnpms.embrapa.br2Engenheira Agrônoma, doutora, Pesquisadora A - Embrapa Milho e Sorgo - claudia@cnpms.embrapa.br3Engenheiro Agrônomo, doutor, Pesquisador A - Embrapa Milho e Sorgo - jurandir@cnpms.embrapa.br2 Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da Embrapamoleculares (SMITH et al., 1997; VARSHNEY et genoma, pela frequência dos alelos e valor do al., 2005). São formados por um a seis Conteúdo de Informação do Polimorfismo (PIC). nucleotídeos repetidos de 10 a 60 vezes em As reações de amplificação foram previamente tandem ao longo da molécula de DNA padronizadas para serem realizadas em (RAFALSKI et al., 1996), flanqueados por multiplex, ou seja, um grupo de reações regiões conservadas. Cada microssatélite realizadas simultaneamente com cada amostra, constitui um loco genético altamente variável, minimizando assim o dispêndio de tempo e multialélico e com um elevado conteúdo reagentes. Os 21 marcadores selecionados informativo de polimorfismo (FERREIRA; foram organizados de modo a formar sete GRATTAPAGLIA, 1998). Possuem elevado tripletes (Tabela 1). Tais conjuntos de tripletes poder discriminatório e, em geral, poucos locos foram testados em quatro linhagens-elite de permitem a completa diferenciação dos milho quanto à amplificação de fragmentos genótipos de interesse, característica relevante, detectados satisfatoriamente pelo equipamento considerando a necessidade de discriminação ABI377. Após vários ajustes na concentração de cultivares muito próximas. dos reagentes e na temperatura de anelamento, foi estabelecido um protocolo de amplificação Com o objetivo de gerar um banco de dados de satisfatória para todos os conjuntos multiplex, frequências alélicas e selecionar um conjunto de que poderá ser empregado em qualquer DNA marcadores com alta reprodutibilidade e genômico de milho, descrito a seguir. As reações informatividade para ser utilizado em processos de amplificação em multiplex foram preparadas de proteção de linhagens de milho e de pureza com volume final de 20 µL, consistindo de 30 ng genética, foi realizada a caracterização com de DNA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, marcadores microssatélites de um painel 1,5mM de MgCl2, 0,5U Taq DNA polimerase contendo 57 linhagens-elite de milho e 55 de (Invitrogen, Carslbad, CA), 0,25 mM dNTPs e 2,5 sorgo entre as empregadas com maior pM de cada um dos pares de iniciadores frequência nos cruzamentos para a obtenção de componentes da reação multiplex. As híbridos no programa de melhoramento da amplificações seguiram-se mediante as Embrapa Milho e Sorgo. seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC Oito sementes de cada linhagem, tanto de milho por cinco minutos, 30 ciclos de 95ºC por um quanto de sorgo, foram plantadas em suporte de minuto, 55ºC por dois minutos e 72ºC por dois isopor contendo orifícios de 3 X 3 cm cada, minutos, elongação final a 72ºC por cinco preenchidos com terra adubada organicamente e minutos. A reação de amplificação foi diluída mantidos em casa de vegetação. Esse número duas vezes em água destilada e 3 µL dessa de sementes foi empregado para verificar a diluição foram misturados a 0,3 µL do padrão homogeneidade do material e assim assegurar GS-500 ROX (Applied Biosystems, Foster City, que o DNA fosse extraído de linhagens puras. O CA), 0,8  µL de formamida HI-DI (Applied DNA genômico foi extraído a partir de folhas Biosystems, Foster City, CA) e 0,4 µL de tampão jovens de pelo menos cinco plantas de cada de carregamento (blue dextran 50mg/ml; EDTA linhagem, de acordo com o método descrito por 25 mM). As amostras foram desnaturadas por Saghai-Maroof et al. (1984). O mesmo foi dois minutos a 95°C e mantidas em gelo até o avaliado em gel de agarose corado com brometo carregamento de 3 µL em gel de poliacrilamida de etídio para verificar sua integridade e 5% (p/v) (Long Ranger Gel Solution, Cambrex); concentração. ureia 6 M; Tris 100 mM; ácido bórico 100 mM e A partir de dados publicados anteriormente por EDTA 2 mM. A eletroforese foi realizada no Padilha (2002) em seu trabalho de sequenciador automático de DNA ABI Prism 377 caracterização de linhagens de milho, foram (Applied Biosystems, Foster City, CA), por 2,5 h selecionados 21 marcadores microssatélites de a 3000V em tampão TBE (Tris-HCl 0,89M; ácido milho informativos, levando em consideração o bórico 0,02M e EDTA 0,02M pH 8,0). Estes seu polimorfismo, distribuição ao longo do conjuntos multiplex vão permitir um ganho de 3tempo e emprego de um número menor de 95ºC por um minuto, 55ºC por dois minutos e reagentes na análise por marcadores 72ºC por dois minutos, e elongação final a 72ºC moleculares de genótipos de milho, facilitando o por dez minutos. Um volume de 2 µL do produto trabalho em larga escala na genotipagem de da reação de PCR diluído três vezes em água milho. destilada foi misturado a 0,2 µL do padrão GS-500 ROX (Applied Biosystems, Foster City, CA), A genotipagem de 55 linhagens de sorgo foi 1 µL de formamida HI-DI (Applied Biosystems, realizada com 15 marcadores microssatélites Foster City, CA) e 0,5 µL de tampão de (Tabela 2), conforme descrito por Smith et al. carregamento (blue dextran 50mg/ml; EDTA 25 (2000). Cada uma das reações de amplificação mM). As amostras foram desnaturadas por cinco em multiplex foi preparada para um volume final minutos a 95°C e mantidas em gelo até o de 20 µL, consistindo de 30 ng de DNA, 20 mM carregamento de 2 µL em gel de poliacrilamida Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5mM de MgCl2, 5% (p/v) (Long Ranger Gel Solution, Cambrex); 0,5U Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carslbad, ureia 6 M; Tris 100 mM; ácido bórico 100 mM e CA), 0,25 mM dNTP e 2,5 pM de cada um dos 5 EDTA 2 mM. A eletroforese foi realizada no pares de iniciadores componentes da reação sequenciador automático de DNA ABI Prism 377 multiplex. As amplificações seguiram-se (Applied Biosystems, Foster City, CA), por 2,5 h mediante as seguintes condições: desnaturação a 3000V em tampão TBE (Tris-HCl 0,89M; ácido inicial a 95ºC por quatro minutos, 25 ciclos de bórico 0,02M e EDTA 0,02M pH 8,0).Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaMicrossatélite Bin Fluorescência Multiplex dupssr14 8.09 TET 1 umc1771 9.04 HEX 1 bnlg182 1.03 6-FAM 1 phi053 3.05 TET 2 umc1862 1.11 6-FAM 2 bnlg1863 8.03 HEX 2 phi084 10.04 TET 3 umc1653 6.07 HEX 3 bnlg589 4.10 6-FAM 3 phi116 7.06 6-FAM 4 dupssr24 2.08 TET 4 bnlg1006 5.00 HEX 4 bnlg2241 3.06 6-FAM 5 umc1019 5.06 TET 5 bnlg161 6.00 HEX 5 umc1084 10.07 TET 6 umc1033 9.02 6-FAM 6 bnlg125 2.02-2.03 HEX 6 umc1016 7.02 6-FAM 7 bnlg1338 2.01 TET 7 umc1008 4.01 HEX 7  Tabela 1: Conjuntos multiplex padronizados para amplificação de microssatélites de milho4Após a reação de amplificação, as bandas foram de sorgo analisados amostraram de maneira analisadas com o auxílio do programa ampla o genoma do sorgo, gerando um total de computacional GeneScan e os tamanhos dos 185 alelos para as 55 linhagens consideradas. alelos foram determinados com o programa Em sorgo, todos os 15 locos microssatélites Genotyper (Applied Biosystems, Foster City, CA). avaliados foram polimórficos nas linhagens A variação genética de cada loco foi medida em estudadas. O número de alelos por loco variou termos do número de alelos por loco e conteúdo de dois (Sb5-256) a 18 (Sb5-206), indicando de informação polimórfica, PIC, de acordo com a ampla diversidade genética entre os genótipos fórmula: avaliados. Os valores de PIC fornecem uma estimativa da força discriminatória do loco, pois, além do número de alelos, é levada em 2 PIC = 1-∑(p) , sendo p a frequência de cada i i consideração também a frequência relativa dos alelo dentro do loco. alelos. Os valores de PIC para os 15 locos microssatélites de sorgo variaram de 0.49 (Sb5-256) a 0.89 (Sb6-57 e Sb4-32) (Tabela 3), com Os produtos da amplificação dos 15 iniciadores PIC médio de 0,76. Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaMicrossatélite Grupo  Ligação Fluorescência Multiplex Sb4-15 E 6-FAM 1 Sb4-121 D 6-FAM 1 Sb4-32 E TET 1 Sb5-236 G HEX 1 Sb6-342 A HEX 1 Sb6-36 C 6-FAM 2 Sb1-1 H 6-FAM 2 Sb1-10 D TET 2 Sb5-256 C TET 2 Sb6-84 F HEX 2 Sb6-42 - 6-FAM 3 Sb6-57 C 6-FAM 3 Sb6-34 I TET 3 Sb5-206 E TET 3 Sb4-72 B HEX 3  Tabela 2: Conjuntos multiplex padronizados para amplificação de microssatélites de sorgo (segundo SMITH et al., 2000)5Os 21 locos microssatélites avaliados em milho por Smith et al. (1997) que utilizaram 131 foram polimórficos nas linhagens estudadas, primers marcados com fluorescência em 58 amplificando um total de 404 alelos. O número linhagens e quatro híbridos de milho e de alelos por loco variou de oito (umc1771 e encontraram valor médio de PIC igual a 0,62. É phi116) a 36 (bnlg1006), indicando ampla possível que tenha sido detectada uma maior variabilidade genética entre os genótipos diversidade genética entre as linhagens-elite da avaliados. Os valores de PIC para os 21 locos Embrapa Milho e Sorgo, pois neste trabalho microssatélites de milho variaram de 0.65 foram empregados apenas os marcadores mais (bnlg589) a 0.96 (bnlg1006) (Tabela 4) com PIC informativos, selecionados a partir do trabalho médio de 0,85. Esse valor foi superior ao obtido anterior de Padilha (2002). Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaLoco Número de Alelos Faixa Alélica (pares de bases) PIC sb4-15 8 116-132 0,74 sb4-121 9 211-226 0,86 sb5-236 12 166-198 0,81 sb4-72 10 168-188 0,71 sb5-206 18 109-147 0,76 sb6-34 11 178-202 0,74 sb6-57 15 276-309 0,89 sb6-42 13 164-232 0,85 sb5-256 2 167-169 0,49 sb6-84 17 170-202 0,83 sb1-10 15 208-308 0,78 sb1-1 16 144-260 0,58 sb6-342 9 265-292 0,63 sb4-32 16 164-194 0,89 sb6-36 14 161-193 0,84  Tabela 3: Características dos 15 locos microssatélites avaliados em linhagens de sorgo6A caracterização de linhagens é essencial para fundamental importância para a implementação um programa de melhoramento e os marcadores dos marcadores microssatélites, tanto para a microssatélites foram eficientes para caracterizar caracterização molecular das linhagens-elite e determinar a variabilidade das linhagens de quanto para a avaliação da pureza genética de milho e sorgo do programa de melhoramento da sementes. As informações moleculares podem Embrapa Milho e Sorgo. Devido ao alto índice de ser utilizadas como uma ferramenta adicional polimorfismo detectado, os conjuntos de pelo melhorista no sentido de explorar o máximo marcadores empregados são indicados para a da variabilidade genética do seu material de obtenção de fingerprints moleculares. As trabalho.informações relacionadas com o padrão de amplificação dos alelos em cada linhagem e com os valores de frequências alélicas foram armazenadas em um banco de dados, de Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaLoco Número de Alelos Faixa Alélica (pares de bases) PIC bnlg1006 36 160-262 0,96 bnlg125 20 310-384 0,92 bnlg1338 20 88-236 0,88 bnlg161 26 82-212 0,92 bnlg182 16 78-404 0,88 bnlg1863 26 114-184 0,92 bnlg2241 14 96-266 0,86 dupssr14 18 70-176 0,79 dupssr24 29 92-152 0,94 phi084 17 82-192 0,88 umc1008 25 62-170 0,92 umc1016 26 92-174 0,93 umc1019 16 70-104 0,90 umc1033 26 84-190 0,95 umc1084 13 104-154 0,68 umc1653 25 104-182 0,92 umc1771 8 110-152 0,68 umc1862 9 67-150 0,68 bnlg589 15 78-208 0,65 phi053 11 74-194 0,82 phi116 8 140-174 0,75  Tabela 4: Características dos 21 locos microssatélites avaliados em linhagens de milho7Caracterização Molecular de Milho e Sorgo para Aplicação nos Programas de Melhoramento da EmbrapaReferências TINGEY, S. 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Caracterização molecular de milho e sorgo para aplicação nos programas de melhoramento da Embrapa.

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