bitstream/CNPMS-2009-09/21372/1/Circ_104.pd

VASCONCELOS, M. J. V. de

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Sete Lagoas, MGDezembro, 2008104ISSN 1518-4269AutoresMaria José Vilaça deVasconcelosFarmac., PhD, BiologiaMolecular.  EmbrapaMilho e Sorgo. Cx. P.151. 35701-970  SeteLagoas, MGmjose@cnpms.embrapa.brOtimização de transformação genética deembriões imaturos de milho por SAATO milho (Zea mays L.) é uma importante espécie cultivada em todo o mundo euma importante fonte de alimento devido à diversidade de formas deutilização,  sendo o cereal mais consumido no planeta. É reconhecido comouma das fontes estratégicas de alimentos que permitem à sociedade modernaproduzir grandes quantidades de proteína e energia, essenciais para a nutriçãohumana e a de animais domésticos.A transformação genética de cereais, principalmente de milho, tem crescidomuito e um grande desafio refere-se à eficiência de transformação genética. Oajuste de metodologias eficientes tem aumentado e a demanda de protocolosque superem esta barreira também. O desenvolvimento de estratégiasadequadas para superar limitações genotípicas de regeneração etransformação de milho, permitindo utilizar genótipos de milho tropical de altaperformance agronômica mas pobres em respostas a cultura tecidos, éessencial a este programa de manipulação genética. Um exemplo deeficiência em transformação genética é o uso da linhagem A188, comadaptação ao clima temperado e muito usada em experimentos detransformação genética mediada por Agrobacteria; mas esta linhagem nãoapresenta características agronômica favoráveis ao clima tropical, o quedificulta o seu uso no desenvolvimento de transgênicos nos trópicosVárias características podem alterar a expressividade dos genes quecontrolam a indução da embriogênese somática e a regeneração de plantas;entre elas, podemos destacar o estádio de desenvolvimento e o estadofisiológico do explante no momento da excisão, interações específicas entre ogenótipo e condições de cultivo da planta doadora e as estações do ano (PrioliE Silva, 1989), a capacidade de transformação das plantas mediadas porAgrobacteria. Dessa forma, até as plantas ou os genótipos consideradosaltamente recalcitrantes podem chegar à morfogênese quando se usaexplantes de plantas que cresceram sob condições ótimas e que estejam emadequado estádio de desenvolvimento associado a uma metodologiaadequada de transformação genética.O desenvolvimento ou a adaptação de um protocolo que aumente a eficiênciade transformação em linhagens tropicais de milho é de grande importânciapara o desenvolvimento desta tecnologia nestas regiões. O desenvolvimentodas técnicas de transformação genética para cereais tem sido relativamentebaixo, principalmente em consequência da sua limitada susceptibilidade àAgrobacterium e à baixa capacidade de regeneração de plantas férteis a partirde protoplastos (Rhodes et al., 1988). A utilização de transformação genéticavia ultrassom e Agrobacterium - SAAT (Sonication Assisted Agrobacteriummediated Transformation), descrita por Trick e Finer (1997), consistindo notratamento de tecidos vegetais com ultrassom antes ou durante a inoculaçãodesses tecidos com Agrobacterium.Circ_104.p65 26/2/2009, 16:3012 Otimização de transformação genética de embriões imaturos de milho por SAATFoto: Ramon C. AlvarengaA sonicação permite que a Agrobacteria atinjaas células mais internas do tecido vegetal porcriar pequenas e uniformes fissuras e canaisatravés dos quais transferem seu DNA para ogenoma das plantas. Várias espécies queapresentavam baixas frequências detransformação com outros métodos deintrodução de DNA exógeno tiveram a eficiênciado processo aumentada quando foram tratadascom SAAT (Trick & Finer, 1997). Foi obtidosucesso com essa técnica emmonocotiledôneas (Triticum aestivum e Zeamays), em dicotiledôneas (Glycine max eVigna unguiculata) e na gimnosperma (Piceaglauca). Monocotiledôneas e certos tecidos dedicotiledôneas não são muito receptivos àtransformação mediada por Agrobacterium.Tanto a bactéria quanto o tecido-alvo a sertransformado podem ser manipulados para quese obtenha um aumento na eficiência detransformação nestas plantas (Frame et al.,2006). Dentre eles, pode-se citar o uso decompostos fenólicos como acetoseringona,indutor de transferência do T-DNA (Stachel etal., 1985), modificações no vetor binário daagrobactéria (Hiei et al., 1994; Ishida et al.,1996), adição de anti-oxidantes no meio de co-cultivo (Perl et al., 1996) e ferimento (Stachel etal., 1985; Horsh et al., 1985; Bidney et al.,1992).Pouco explorado tem sido o uso de sonicaçãopara ferir e modificar o tecido a sertransformado, tanto com DNA isolado (Joersboe Brunstedt, 1990, 1992; Zhang et al., 1991),quanto com Agrobacterium (Trick e Finer,1997). No trabalho pioneiro, utilizando SAAT, osautores relataram o uso de tecido foliar decaupi, embriões imaturos de Zea mays,sementes de Triticum aestivum e Picea glaucacomo explantes iniciais para a aplicação depulsos de ultrassom. Como uma alternativapara aumentar a eficiência de transformaçãogenética do milho, foram avaliados nestetrabalho o efeito do pré-aquecimento doexplante-alvo (embriões imaturos) e o uso desonicação na transformação genética de milhotropical mediada por Agrobacterium - SAAT.A metodologia de SAAT descrita por Trick e Finer(1997) foi modificada como descrito a seguir:linhagens de milho com 10 a 15 dias após afecundação foram desinfestadas superficialmentepor imersão em  70% etanol, seguido deincubação por 40min em solução de 2,5% dehipoclorito de sódio e lavagens três vezes comágua deionizada estéril. Embriões medindoaproximadamente 1 a 1,5mm de comprimentoforam extraídos com o auxílio de uma pinça einoculados em meio de cultura contendo os saisbásicos de Chu et al. (1975) suplementado com2,9 g/L de prolina, 3% (p/v) de sacarose, 5 mg/Lde tiamina, 2 mg/L de glicina, 100 mg/L decasaminoácios, 100mg/L de inositol, 30 µM dedicamba e 100 µM de acetoseringona. O eixoembrionário foi inoculado em contato com o meio.Em seguida, foram incubadas à temperatura de25°C por dois dias na ausência de luz. Após esteperíodo, os embriões foram submetidos aotratamento SAAT com a Agrobacteriumtumefaciens LBA4404. Foi utilizado paratransformação genética do milho o plasmadopCAMBIA C2, contendo região codificante pararesistência a kanamicina e higromicina.As bactérias foram crescidas em meio LB comkanamicina por 16h a 27ºC, centrifugada a 1500gpor 5 min e ressuspensas em meio de culturacontendo os sais básicos de MS (Murashige eSkoog, 1962), suplementado com 3% (p/v) desacarose. A suspensão bacteriana foi diluída aOD600 entre 0,5-0,6 com o mesmo meio líquido.Os embriões foram transferidos para tubos demicrocentrífuga de capacidade de 1,5 mL, sendoem seguida adicionado 1 mL da suspensãobacteriana e submetidos a diferentes tratamentostérmicos (Banho Maria) e de ultrassom utilizandoum sonicador Fisherbrand FS5 e controle detempo por um cronômetro digital,  conforme aTabela 1.Circ_104.p65 26/2/2009, 16:3023Otimização de transformação genética de embriões imaturos de milho por SAATFoto: Ramon C. AlvarengaFoto: Ramon C. AlvarengaTabela 1. Tratamentos utilizados nos experimentosApós os tratamentos, os embriões foramtransferidos para o meio de cultura contendo ossais básicos de Chu et al. (1975), suplementadocom 3% (p/v) de sacarose, 30 mM de Dicamba e100 mM de acetoseringona. Após dois dias, osembriões foram lavados com água destiladaautoclavada, secos em papel de filtro estéril etransferidos para meio de Chu et al. (1975)suplementado com 300 mg/L de Timentin. Apósdois dias adicionais no meio com antibiótico, osembriões foram analisados para a atividade deGUS de acordo com Jefferson (1987). Duassemanas após, os embriões foram transferidospara o mesmo meio descrito acima,suplementado com 10mg/L de higromicina.Em todos os embriões analisados, o tratamentocom SAAT teve a maior frequência de expressãotransiente de GUS (Tabela 2). A maioria dosembriões inoculados com Agrobacterium forampositivos para GUS e muito baixos ou nulosquando inoculados com Agrobacterium e semSAAT. Aplicando-se pulsos de ultrassom, aexpressão aumentou. De maneira geral, aextensão dos ferimentos tornou-se maior àmedida em que a duração do pulso de ultrassomaumentou. Acredita-se que o aumentosignificativo na expressão do gene repórter obtidoem tecidos tratados com SAAT sejaconsequência dos ferimentos resultantes dosporos promovidos pelo ultrassom (Trick & Finer,1997).Tratamentos Descrição do tratamento01 Embriões + Agrobacterium + sonicação por 30seg02 Embriões + pré-tratamento a 37°C por 2,5min + Agrobacterium + sonicaçãopor 30seg + resfriamento em gelo por 1min03 Embriões + pré-tratamento a 37°C por 5min + Agrobacterium + sonicaçãopor 30seg + resfriamento em gelo por 1min04 Embriões + pré-tratamento a 37°C por 10min + Agrobacterium + sonicaçãopor 30seg + resfriamento em gelo por 1min05 Controle A (ausência de sonicação)O melhor tratamento, segundo dados deexpressão transiente, foi o tratamento em que osembriões tiveram o pré-tratamento a 37°C por 5min com Agrobacterium  e sonicação por 30sege, em seguida, resfriamento em gelo por 1 min. Oaquecimento antes da submissão dos embriões àtécnica do SAAT provavelmente tornou a parede ea membrana celular mais permeáveis,favorecendo a transformação. O tratamento depré-aquecimento mais drástico a 10 min afetounegativamente a eficiência de transformação paraexpressão transiente, quando comparados comos outros tratamentos. Calos e folhas das plantassupostamente transgênicas foram coletados e ostestes histoquímicos confirmaram a presença dogene GUS. Para cada tratamento, foramcolocadas plantas para enraizamento nosdiferentes tratamentos e aclimatadas e levadaspara casa de vegetação.Os calos embriogênicos formados foramtransferidos para meio de regeneração contendoos sais básicos de Chu et al. (1975),suplementados com 2% (p/v) de sacarose, 1 mg/L de BAP e 0,5mg/L de ácido indol butírico, 300mg/L de Timentin e 5mg/L de higromicina paraevitar a formação de regenerantes “escape” (nãotransformados).  As condições de cultivo foramde  25 ± 2°C, fotoperíodo de 16 h e intensidadeluminosa em torno de 36 µmoles m-2.s-1.Circ_104.p65 26/2/2009, 16:3034 Otimização de transformação genética de embriões imaturos de milho por SAATCom aproximadamente 10 cm de altura, osregenerantes foram individualizados etransferidos para meio de enraizamento contendoos sais básicos de MS (Murashige e Skoog, 1962)na metade da concentração dos sais,suplementado com 1,5% (p/v) de sacarose e 1mg/L de ANA (ácido naftaleno acético). Após oprocesso de enraizamento, as plantas foramretiradas da condição in vitro e as raízes foramlavadas e plantadas em vasos plásticos contendoa mistura solo–vermiculita na proporção 1:1. Emseguida, foram conduzidas à casa de vegetaçãopara o processo de aclimatação, onde foramirrigadas conforme as necessidades.ConclusãoComo conclusão deste trabalho, pode-se inferirque a técnica de SAAT consiste em umaalternativa para a transformação de plantas, umavez que os microporos produzidos por ultrassomfazem com que a Agrobacterium atinjaeficientemente os tecidos mais profundos daepiderme, aumentando a frequência de eventosde transformação. SAAT é um metodo de baixocusto e que pode melhorar significativamente aeficiência da transformação de Agrobacterium emespécies com baixa eficiencia em transformaçãomediada por Agrobacterium. Neste trabalho, omelhor tratamento foi obtido quando os embriõespassaram por um período de pré-aquecimento de5 min antes de ser submetido ao SAAT.Modelo  de protocolo para SAAT e expressãotransiente de GUS para milho tropical1. Crescer a Agrobacteria contendo o plasmídiode interesse por uma noite à temperaturaambiente (27°C) em LBS (10 g/L Triptona, 5 g/L extrato levedura, 5 g/L de sacarose, 5 g/L decloreto de sódio) com antibiótico agitação a150 rpm.2. Centrifugar a Agrobacteria a 1500g durante 10min e lavar o precipitado por duas vezes comD40 médio (sais MS, vitaminas B5, 40 mg/L2,4-D; 6% de sacarose, pH 7,0). Depois dasegunda lavagem, diluir a Agrobacteria àdensidade ótica de 0,5-0,6 a 600 nm.3. Extrair os embriões imaturos de sementes demilho esterilizadas superficialmente (embriõescom 1-1,5mm de comprimento) e colocá-losem meio de cultura com os sais básicos deChu et al. (1975), suplementados com 2% (p/v) de sacarose, + 0,2% Gelrite - embriõesforam colhidos até o suficiente para otratamento de SAAT .4. Cerca de 10 embriões foram colocados em umtubo 1,5 mL microcentrífuga, submetidos ounão ao tratamento térmico, juntamente com0,5 mL da suspensão Agrobacteria. Sonicar osembriões por 30seg.5. Cerca de 5min após SAAT tratamento, inocularos embriões com Agrobacteria - foi removidopor blotting sobre um papel filtro estéril.Tabela 2. Expressão transiente, porcentagem de formação de embriões somáticos e regeneração deplantas de milho (L048) transformados pelo método SAATTratamento X-gluc (%) Embriões somáticos(%)Regeneração (%)Trat. 1 C2 54,5 42,5 17,6Trat. 2 C2 62,5 31,0 21,4Trat. 3 C2 87,5 40,0 25,0Trat 4 C2 37,5 38,5 23,5Trat. 5 Controle 0,0 a 5% 75,0 38,0Circ_104.p65 26/2/2009, 16:3045Otimização de transformação genética de embriões imaturos de milho por SAAT6. Coletar os embriões imaturos colocados emmeio contendo sais básicos de Chu et al.(1975), suplementados com 2% (p/v) desacarose, 1 mg/L de BAP e 0,5mg/L de ácidoindol butírico, 300 mg/L de Timentin e 5 mg/Lde higromicina + 0,2% Gelrite por dois dias esubmetê-los a testes de GUS para verificar aexpressão transiente (GUS).Literatura consultadaBECHTOLD, N.; ELLIS, J.; PELLETIER, G. 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Guimarães, Clenio  Araujo, FlaviaFrança Teixeira, Jurandir Vieira MagalhãesRevisão de texto: Clenio AraujoEditoração eletrônica: Tânia Mara Assunção BarbosaComitê depublicaçõesExpedienteCircularTécnica, 104PERL, A.; LOTAN, O.; ABU-ABIED, M.; HOLLAND,D. Establishment of an Agrobacterium-mediatedsystem for grape (Vitis vinifera L.): The role ofantioxidants during grape-Agrobacteriuminteractions. Nature Biotechnology, New York, v.14, p. 624-628, 1996RHODES, C. A.; PIERCE, D. A.; METTLER, I. J.;MASCARENHAS, D.; DETMER, J. J. Geneticallytransformed maize plants from protoplasts.Sciences, New York, v. 240, p. 204-207, 1988SANFORD, J.C. The biolistic process. TrendsBiotechnology., 6: 299-302, 1988STACHEL, S. E.; MESSENS, E.; VAN MONTAGU,M.; ZAMBRYNSKI, P. Identification of signalmolecules produced by wounded plant cells withactivate the T-DNA transfer process inAgrobacterium tumefaciens. Nature, London, v.318, p.  624-629, 1985TRICK, H. N.; FINER, J. 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