BRESSAN, W.

COELHO, V. T. da S.

DE PAOLI, H. C.

FIGUEIREDO, J. E. F.

PRATES, M. V.

PURCINO, A. A. C.

ROCHA, T. L.

Portuguese

Infoteca-e

ComunicadoTécnico67ISSN 1679-0162Outubro, 2003Sete Lagoas, MGDesenvolvimento deMarcador Molecular paraBacillus subtilis UtilizandoProteomicsJosé Edson Fontes Figueiredo1Vinicios Tadeu da Silva Coelho2Henrique Cestari De Paoli2Wellington Bressan3Antônio Alvaro Corcetti Purcino3Tales Lima Rocha4Maura Vianna Prates41Biólogo, Doutor, Embrapa Milho e Sorgo. Caixa Postal 151, CEP 35701-970  Sete  Lagoas, MG, Brasil2Estudante do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário Metodista Izabela Hendrix, Caixa Postal 46,CEP 30160-012  Belo Horizonte, MG, Brasil3Eng. Agr., Doutor, Embrapa Milho e Sorgo. Caixa Postal 151, CEP 35701-970  Sete  Lagoas, MG4Biólogo, Doutor, Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia/DF, Parque Estação Biológica Final Av. W/5 Norte,CEP 70770-900  Brasília-DF, BrasilIntroduçãoMarcadores moleculares estão sendoamplamente utilizados na agricultura. Entreas várias aplicações práticas, destacam-sea identificação de germoplasma, aeliminação de réplicas em bancos degermoplasma, fingerprinting de linhagens eraças, identificação de genes associadoscom a performance da planta (genes deresistência ou tolerância a doenças eestresse, proteínas de reserva, caracteresquantitativos), entre outros. Em todos essescasos, a definição da estratégia que deveráser adotada precisa considerar os custospara a obtenção dos marcadores. Ênfasecrescente tem sido dada para identificarmarcadores menos onerosos.Marcadores bioquímicos constituem um tipoespecial de marcador molecular que secaracteriza pela análise do produto daexpressão gênica. Destacam-se dois tiposprincipais: isoenzimas e proteínas. Essesmarcadores também são definidos comomarcadores fenotípicos, pois podemresultar da interação genótipo/ambiente.Embora de aplicação limitada, o uso dessesmarcadores em algumas áreas ou em casosespeciais fornece informações seguras eúteis para a identificação de indivíduos.Recentemente, as técnicas de SDS-PAGE,RAPD-PCR, ARDRA e seqüenciamento degenes ribossomais foram empregadas noLaboratório de Bioquímica Molecular deMicrorganismos da Embrapa Milho e Sorgo,para identificar bactérias endofíticasisoladas do milho. Neste estudo, foiverificada, em todos os isolados, apresença de um polipeptídio deaproximadamente 42 kDa e cuja expressãoera bastante elevada (Figura 1). O objetivodeste trabalho consistiu em aprofundar os2estudos sobre o polipeptídio de 42 kDa(marcador bioquímico) do isolado CMS 23,visando o desenvolvimento de marcadoresde B. subtilis depositadas no GenBank. Oalinhamento da seqüência de aminoácidosdo peptídio seqüenciado com 54 proteínasflagelina depositadas no GenBank revelou apresença de resíduos altamenteconservados em todas as espéciesanalisadas, bem como a conservação dessepeptídio entre diferentes estirpes de B.subtilis (Figura 3).A análise das seqüências de aminoácidostambém revelou a presença deaproximadamente 50 resíduos deaminoácidos na extremidade amino-terminalda proteína flagelina, em todas as espéciesestudadas, mas ausentes em CMS 23. Apossibilidade de ocorrência de proteóliseinespecífica durante o processo depurificação foi descartada, pois produziriaambigüidade durante o seqüenciamento dopolipeptídio e, no presente estudo, aseqüência gerada teve 100% deconfiabilidade. Do mesmo modo, aocorrência de clivagem específica na regiãoamino-terminal do polipeptídio de 42 kDapor atividade de protease durante apurificação parece pouco provável. Épossível que o polipeptídio seja processadopela célula bacteriana e os resíduos amino-terminal (~50 aa) sejam perdidos durante oprocesso de maturação da proteína.Extrato protéico total bacteriano foiinicialmente fracionado em sulfato deamônia, em concentrações que variaramentre  10% e 70%. Amostras dos produtosprecipitados foram dialisados contratampão PBS, concentradas e resolvidas emgéis SDS-PAGE 12%, para identificação dafração que continha o polipeptídio deinteresse. Em seguida, foi realizado um gelpreparativo e a banda correspondente aopolipeptídio de 42 kDa foi cortada do gel,eletroeluída e concentrada com microcon.O polipeptídio purificado foi aplicadonovamente em gel SDS-PAGE, paraverificar a pureza e a integridade dapreparação (Figura 2). O seqüenciamentoda região amino-terminal do polipeptídiopurificado foi realizado em seqüenciadorautomático de proteínas, gerando umaseqüência contendo 25 resíduos deaminoácidos(GLDMASKNAQDGISLIQTSEGALNET). Aanálise de seqüências do peptídio comproteínas depositadas no GenBank reveloualta similaridade com flagelina de Bacillussubtilis. Esse dado confirmou a análiseprévia de seqüências de rDNA do isoladoCMS 23, realizada no Laboratório deBioquímica Molecular do NBIO, que indicoualta similaridade com seqüências de rDNAmoleculares de DNA para a identificação debactérias endofíticas do milho.Figura 1.  SDS-PAGE de extrato protéico total de bactériasendofíticas isoladas do milho. M = marcador molecular.Figura 2. SDS-PAGE de extrato total (1) e da proteína de ~42kDa purificada (2) do isolado CMS23. M = marcador de pesomolecular .3Figura 3. Alinhamento parcial de seqüência de aminoácidos da proteína flagelina. Os pontos representam aminoácidos idênticosàqueles assinalados no peptídio seqüenciado (CMS 23) e os resíduos conservados em todas as seqüências foram destacados(sombreado). Os números indicam a posição da seqüência do peptídio nas proteínas e cada asterisco corresponde ao número deisoformas da espécie representada, cuja seqüência é idêntica ao peptídio mostrado na figura.4Visando elucidar esta questão, a proteínaflagelina do isolado CMS 23 foi novamentepurificada por HPLC (Departamento deQuímica, UFMG) e será novamenteseqüenciada.A análise de genes codificadores para aproteína flagelina revelou a existência deseqüências de DNA específicas para aespécie B. subtilis (Figura 4), bem comodiferenças entre várias estirpes de B.subtilis. Essas informações foram utilizadaspara desenhar iniciadores específicos paraamplificação de DNA de B. subtilis e,juntamente com rDNA e RFLP, poderão serutilizados para genotipagem de isoladospotencialmente úteis em processosagrícolas e biotecnológicos. Iniciadoresespecíficos para o gene da proteínaflagelina de B. subtilis serão utilizados paraamplificação de DNA extraído de plantas demilho e, juntamente com os anticorpos,possibilitarão monitorar a eficácia deinóculos e o processo de colonização daplanta hospedeira pela bactéria.ConclusãoA análise do perfil eletroforético deproteínas totais de bactérias endofíticasisoladas do milho possibilitou aidentificação de polipeptídios altamenteacumulados. A purificação do polipeptídiocom expressão aumentada possibilitou aprodução de anticorpos policlonais emcamundongos, para a identificação de B.subtilis em milho e também a determinaçãoda seqüência de aminoácidos amino-terminal da proteína. Análises deseqüências de aminoácidos e denucleotídeos codificadores da proteínaflagelina possibilitaram a identificação deregiões conservadas em B. subtilis, masvariável em outras espécies. Essainformação foi empregada para desenhariniciadores específicos que serão utilizadospara diagnosticar e monitorar plantas demilho inoculadas com estirpes de B. subtilisde interesse agrícola. No presente estudo, aanálise reversa por proteomics  possibilitoua identificação e o desenvolvimento demarcadores moleculares para diagnósticode B. subtilis.5Figura 4. Alinhamento parcial de seqüências codantes para a proteína flagelina. Apenas a região do DNA empregada para desenharos iniciadores foi representada. Os pontos e tracejados representam, respectivamente, nucleotídeos idênticos à primeira linha e“gaps” para possibilitar o melhor alinhamento das seqüências. A seqüência codificadora do peptídio seqüenciado (25 resíduos deaminoácidos) encontra-se sombreada. Cth* = Clostridium thermocellum (acesso GenBank ZAABG0 2000025); Cse* =Clostridium septicum (acesso GenBank AB058933); Cse** = Clostridium septicum (acesso GenBank AB058935); Cha =Clostridium haemolyticum (acesso GenBank AB058939);  Cth** = Clostridium thermocellum (acesso GenBank AB039910); Bs1= Bacillus subtilis isolado6  Comitê dePublicaçõesPresidente:  Ivan CruzSecretário-Executivo: Frederico Ozanan Machado DurãesMembros: Antônio Carlos de Oliveira, Arnaldo Ferreira daSilva, Carlos Roberto Casela, Fernando Tavares Fernandes ePaulo Afonso VianaExpediente Supervisor editorial: José Heitor VasconcellosRevisão de texto: Dilermando Lúcio de OliveiraEditoração eletrôncia:  Tânia Mara Assunção BarbosaComunicadoTécnico, 67Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Milho e SorgoCaixa Postal 151 CEP 35701-970 Sete Lagoas, MGFone: 0xx31 3779 1000Fax: 0xx31 3779 1088E-mail: sac@cnpms.embrapa.br1ª edição1ª impressão (2003) Tiragem: 200Figura 4. Continuação

Desenvolvimento de marcador molecular para Bacillus subtilis utilizando proteomics.

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Desenvolvimento de marcador molecular para Bacillus subtilis utilizando proteomics.

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