FIGUEIREDO, J. E. F.

KARAM, D.

NESSEN, S. J.

WARD, S. M.

WESTRA, P.

Portuguese

Infoteca-e

ComunicadoTécnico71ISSN 1679-0162Outubro, 2003Sete Lagoas, MGDiversidade Genética dePlantas Daninhas Reveladapor AFLPI – Proso Millet (Panicum miliaceum,L.)Décio Karam1Sarah M. Ward2Philip Westra3Scott J. Nessen3José Edson Fontes Figueiredo11 Eng. Agr., PhD, Embrapa Milho e Sorgo – Caixa Postal 151, CEP 35701-970  Sete Lagoas, MG, Brasil3 Eng. Agr., PhD. Department of Soil Crop Science, Colorado State University, Fort Collins, CO 805232 Eng. Agr., PhD, epartment of Bioagricultural Sciences and Pest Management, Colorado State University, Fort  Collins, CO 80523IntroduçãoAFLP (Amplified fragment lengthpolymorphism) é uma técnica para estudarpolimorfismo genético em populações quereúne algumas estratégias empregadas pelastécnicas de RFLP e RAPD, com as vantagensde detectar múltiplos locos por reação eapresentar alta repetibilidade (Jain et al.,1994; Hill et al., 1996). O polimorfismogerado por AFLP apresenta herançamendeliana e pode ser usado para estudarparentesco e a diversidade genética dentro eentre populações, para desenvolvermarcadores moleculares e para o mapeamentode genes de interesse. Contudo, a utilizaçãode AFLP para fingerprinting de DNA genômicofoi bastante limitada inicialmente, devido ànecessidade de se usar marcação comfluoresceína ou com isótopos radioativos.Posteriormente, foram desenvolvidosprotocolos de coloração com prata,possibilitando dispensar o emprego deradioatividade e sem prejuízo para o poder deresolução da técnica.Este estudo foi conduzido com a finalidade depadronizar a técnica de AFLP, empregando ométodo de coloração com prata. O ajustedessa metodologia visou principalmente arealização de estudos posteriores sobre adiversidade genética de plantas invasorasimportantes para as culturas do milho e dosorgo.Material e MétodosO material biológico consistiu de 12populações de proso millet (Panicummiliaceum, L.) depositadas no Banco deGermoplasma da Colorado State University,Fort Collins, CO, USA. As populações2 Diversidade Genética de Plantas Daninhas Revelada por AFLP...analisadas consistiram de três biótiposcultivados (South Dakota domestic brown,Colorado domestic white e Colorado domesticorange) e nove biótipos selvagens (Minnesota-Cambridge wild olive, Canada-Rosemountwild black, Oregon-Grand Island wild olive,Ontario-Canada Huron County wild black,Nebraska-Panhandle Center wild tan,Wyoming-Platte County wild brown,Colorado-weld County wild black, Colorado-Weld County wild tan e Colorado wild white).Para cada população de proso millet, foramutilizadas oito plantas desenvolvidas desementes selecionadas aleatoriamente.O DNA usado nas reações foi extraído defolhas frescas, com o kit Dneasy Plant MiniKit (Qiagen Inc, Valencia, CA 91355), e aqualidade do DNA foi analisada emespectrofotômetro (UV 260/280 nm) e emgéis de agarose a 1%, corados com brometode etídio. A otimização da metodologia deAFLP para estudos em proso millet foibaseada em dois kits de reagentes, AFLPAnalysis System I e AFLP Starter Primer Kit,comercializados pela empresa GIBCO/BRL.Após os testes iniciais sugeridos pelofabricante, os resultados das amplificaçõesnão foram satisfatórios e, portanto, ajustestiveram que ser feitos na metodologia original.As modificações foram: a) para a pré-amplificação, a concentração do DNAgenômico foi de 500 ng e a temperatura deanelamento foi de 52 °C; b) o produto da pré-amplificação foi diluído 1:4 (v/v) em tampãoTE e; c) para a amplificação seletiva do DNA,foram utilizados 2 mL da diluição do produtopré-amplificado (1:4), 1 U de Taq DNApolymerase e o volume final da reação foi de20 mL. A amplificação seletiva foi feita usandooito combinações de pares de iniciadores porreação, dois/três (EcoR-TC / Mse-CAA; EcoR-TG / Mse-CTC), e três/três (EcoR-AAG / Mse-CAA; EcoR-AGG / Mse-CTT; Eco-AAG / Mse-CAG; EcoR-AGG /  Mse-CTA; EcoR-AAC /Mse-CTT; EcoR-ACT / Mse-CAA). O programautilizado para o PCR foi aquele indicado pelofabricante (GIBCO/BRL). A pré-amplificação ea amplificação seletiva foram realizadas notermociclador PTC-100TM programmableThermal Controller (MJ Research, Inc). Areação final foi analisada em gel de acrilamidaa 5,3% corado com prata, que consistiu emincubar os géis com ácido acético a 10%, sobagitação durante 5 min, seguido de duaslavagens com água por dois minutos. Acoloração com prata foi desenvolvida emsolução contendo 2 g  de nitrato de prata; 3mL de formamida a 37%, em dois litros deágua por 30 min. Em seguida, os géis foramlavados com água por 10 s e a coloraçãodesenvolvida em solução contendo 60 g decarbonato de sódio (Fisher Chemical); 3 mL deformamida e 400 mL tiosulfato de sódio (FisherChemical). O processo de coloração foiinterrompido com ácido acético a 10%, tãologo as bandas foram visualizadas.Resultados e DiscussãoGel de acrilamida com alta resolução sem usode isótopos radioativos é uma técnicaeficiente para visualizar fragmentos de DNAamplificados por PCR. O método de coloraçãocom prata também é preferível em relação aoprotocolo para AFLP descrito originalmente,pois elimina a necessidade e os riscos detrabalhar com radioatividade.Foram testadas oito combinações de pares deiniciadores com dois/três e três/trêsnucleotídeos seletivos na extremidade 3’. Ascombinações de iniciadores com dois/trêsnucleotídeos seletivos foram as queproduziram maior quantidade de fragmentosamplificados de DNA (Figura 1), mas ascombinações de iniciadores com três/trêsnucleotídeos seletivos foram as que gerarammaior número de fragmentos de DNApolimórficos (Figura 2). Blears et al. (1998),em uma revisão sobre a técnica de AFLP esuas aplicações, afirmaram que genomaspequenos (106-107 pares de bases) necessitamde apenas um ou dois nucleotídeos seletivosna extremidade 3’ de cada iniciador para queo polimorfismo de DNA seja revelado,enquanto genomas mais complexos (108-1010pares de bases) requereriam nucleotídeos3seletivos adicionais. Em proso millet, que éuma espécie com genoma pequeno (106 paresde bases), combinações de iniciadores comdois nucleotídeos seletivos não foram capazesde revelar o polimorfismo genético existenteentre os biótipos (dados não mostrados),enquanto a combinação de primers com trêsnucleotídeos seletivos foi efetiva, produzindocada combinação, em média, oito fragmentosde DNA polimórfico (Figura 1). No total de450 fragmentos amplificados, 339 foram bemseparados nos géis e, entre eles, 39 bandaspolimórficas foram identificadas. Ascombinações de iniciadores, Mse-CTT / EcoR-ACC and Mse-CAA / EcoR-ACT foram as maisinformativas, produzindo, cada uma, emmédia, oito fragmentos de DNA polimórficos.As bandas de DNA polimórficas foramescrutinadas pela presença (computada como1) e ausência (computada como 0) eanalisadas pelo método UPGMA (unweightedpair-group method with arithmetical averages)do software NTSYS-PC, versão 2.02j (ExeterSoftware). O programa “tree” gerou umdendograma mostrando a relação filogenéticaentre os diferentes biótipos de proso millet(Figura 3). Esse procedimento possibilitou aseparação dos biótipos de proso millet emdois grupos distintos, sendo um formadoapenas por biótipos selvagens típicos(Nebraska-Panhandle Center wild tan,Wyoming-Platte County wild brown eColorado-Wed County wild tan) e o segundogrupo composto por formas domesticadas(South Dakota domestic brown, Coloradodomestic white e Colorado domestic orange)e biótipos selvagens, que apresentam algumascaracterísticas fenotípicas de biótiposFigura 1. Padrão AFLP de DNA genômico de biótipos de prosomillet. Foram usadas as combinações de iniciadores Mse-CAA /EcoR-TC (A) e Mse-CTC/EcoR-TG (B). Os números de 1 a 12correspondem, respectivamente, aos biótipos: Minnesota-Cambridge wild olive; Canada-Rosemount wild back; Oregon-Grand Island wild olive; Ontario, Canada-Huron County wildblack; Nebraska-Panhandle Center wild tan; Wyoming-PlatteCounty wild brown; Colorado-Weld County wild black;Colorado-Weld County wild tan; South Dakota domestic brown;Colorado domestic white; Colorado domestic orange, andColorado wild white. M = marcador de peso molecular 10pb.Figura 2. Padrão AFLP de DNA genômico de biótipos de prosomillet. Foram usadas as combinações de iniciadores Mse-CTT /EcoR-AAC (A) e Mse-CAA / EcoR-ACT (B). Os números de 1 a12 correspondem, respectivamente, aos biótipos: Minnesota-Cambridge wild olive; Canada-Rosemount wild back; Oregon-Grand Island wild olive; Ontario, Canada-Huron County wildblack; Nebraska-Panhandle Center wild tan; Wyoming-PlatteCounty wild brown; Colorado-Weld County wild black;Colorado-Weld County wild tan; South Dakota domestic brown;Colorado domestic white; Colorado domestic orange, andColorado wild white. M = marcador de peso molecular 10pb.4 Diversidade Genética de Plantas Daninhas Revelada por AFLP...  Comitê dePublicaçõesPresidente:  Ivan CruzSecretário-Executivo: Frederico Ozanan Machado DurãesMembros: Antônio Carlos de Oliveira, Arnaldo Ferreira daSilva, Carlos Roberto Casela, Fernando Tavares Fernandes ePaulo Afonso VianaExpediente Supervisor editorial: José Heitor VasconcellosRevisão de texto: Dilermando Lúcio de OliveiraEditoração eletrôncia:  Tânia Mara Assunção BarbosaComunicadoTécnico, 71Exemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Milho e SorgoCaixa Postal 151 CEP 35701-970 Sete Lagoas, MGFone: 0xx31 3779 1000Fax: 0xx31 3779 1088E-mail: sac@cnpms.embrapa.br1ª edição1ª impressão (2003) Tiragem: 200cultivados (Minnesota-Cambridge wild olive,Canada-Rosemount wild black, Oregon-GrandIsland wild olive, Canada-Huron County wildblack, Colorado-weld County wild black eColorado wild white), tais como, ausência dedormência das sementes e taxa relativamenteelevada de crescimento radicular durante agerminação da semente.Figure 3. Dendrograma de doze biótipos de proso millet reveladopor “UPGMA cluster analysis”, baseado em algorítimo NEI72. Osnúmeros no dendrograma correspondem aos biótipos: 1 –Minnesota-Cambridge wild olive, 2 – Canada-Rosemount wildblack, 3 – Oregon-Grand Island wild olive, 4 – Canada-HuronCounty wild black, 5 –  Nebraska-Panhandle Center wild tan, 6– Wyoming-Platte County wild brown, 7 - Colorado-WeldCounty wild black, 8 - Colorado-Weld County wild tan, 9 -South Dakota domestic brown, 10 - Colorado domestic white,11 - Colorado domestic orange, 12 - Colorado wild white.Vos et al. (1995) afirmaram que a técnica deAFLP permite detectar entre 50 e 100fragmentos amplificados por reação. Nopresente estudo, foram observados, em média,56 fragmentos de DNA por gel, indicando quea resolução dos fragmentos de DNA coradoscom prata está dentro da faixa observadaquando isótopos radioativos são empregados.A percentagem de polimorfismo genético(11%) revelada pela técnica de AFLP em prosomillet e a resolução satisfatória dosfragmentos de DNA nos géis de acrilamidacorados pela prata mostraram que a técnicade AFLP poderá ser muito útil para estudar avariabilidade genética e estabelecer relaçõesfilogenéticas em populações de plantasdaninhas às culturas do milho e do sorgo.Esses estudos possibilitarão melhorentendimento sobre a dinâmica populacionale o manejo mais adequado no uso deherbicidas.Referências BibliográficasBlears MJ, De Grandis SA, Lee H andTrevors JT (1998) Amplified fragmentlength polymorphism (AFLP): a review ofthe procedure and its application. J IndMicrob Biotec 21:99-114.Hill M, Witsenboer H, Zabeau M and VosP (1996) PCR-based fingerprinting usingAFLPs as a tool for studying geneticrelationships in Lactuca spp. Theoreticaland  Applied Genetics 93:1202-1210.Jain A, Bhatia S, Banga SS, Prakash S andLakshmikumaran M (1994) Potential use ofrandom amplified polymorphic DNA  (RAPD)technique to study the genetic diversity inIndian mustard (Brassica juncea) ant itsrelationship to heterosis. Theor Appl Genet88:116-122.Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M,Van de Lee T, Hornes M, Frijters A, PotJ, Peleman J, Kuiper M and Zabeau M(1995) AFLP: a new technique for DNAfingerprinting. Nucleic Acids Research23:4407-4414.Zabeau M (1992) European PatentApplication, publication no. EP0534858.Zabeau M and Vos P (1993) EuropeanPatent Application, publication no. EP0534858.

Diversidade genética de plantas daninhas revelada por AFLP. I. Proso Millet (Panicum miliaceum, L.).

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