GOMES, P. C.

GUIMARAES, C. T.

LANA, U. G. de P.

MAGALHAES, J. V. de

OLIVEIRA, B. C. F. S.

TINOCO, C. F. da S.

Portuguese

Infoteca-e

	 Documentos 104Ubiraci Gomes de Paula Lana Priscila Cordeiro Gomes Carlos Fasane da Silva Tinoco Belkiss Cristina França Silva OliveiraClaudia Teixeira Guimarães Jurandir Vieira de Magalhães Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga EscalaEmbrapa Milho e Sorgo Sete Lagoas, MG2010ISSN 1518-4277 Dezembro, 2010Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaCentro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo Ministério da Agricultura, Pecuária e AbastecimentoExemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Milho e SorgoRod. MG 424 Km 45Caixa Postal 151CEP 35701-970 Sete Lagoas, MGFone: (31) 3027-1100Fax: (31) 3027-1188Home page: www.cnpms.embrapa.brE-mail: sac@cnpms.embrapa.brComitê de Publicações da UnidadePresidente: Antônio Carlos de OliveiraSecretário-Executivo: Elena Charlotte LandauMembros: Flávio Dessaune Tardin, Eliane Aparecida Gomes, Paulo Afonso Viana, João Herbert Moreira Viana, Guilherme Ferreira Via-na e Rosângela Lacerda de CastroSupervisão editorial: Adriana NoceRevisão de texto: Antonio Claudio da Silva BarrosNormalização bibliográfica: Rosângela Lacerda de CastroTratamento de ilustrações: Tânia Mara Assunção BarbosaEditoração eletrônica: Tânia Mara Assunção Barbosa Foto(s) da capa: Carlos Fasane da Silva Tinoco 1a edição1a impressão (2010): on lineTodos os direitos reservadosA reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em par-te, constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)Embrapa Milho e Sorgo © Embrapa 2010Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para extração de DNA de         tecido vegetal em larga escala /  Ubiraci Gomes de Paula Lana         [et al.]. -- Sete Lagoas : Embrapa Milho e Sorgo,  2010.       19 p. : il. -- (Documentos / Embrapa Milho e Sorgo, ISSN 1518-4277; 104).        1. Biologia molecular. 2. Milho. 3. Sorgo. 4. Equipamento. I. Lana, Ubiraci Gomes de Paula. II. Série.                                                                                                                                                                                            CDD 574.88 (21. ed.)Ubiraci Gomes de Paula LanaQuímico, Doutorando em Genética, Analista da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG. ubiraci@cnpms.embrapa.br Priscila Cordeiro GomesFarmacêutica, MSc em Ciência de Alimentos, Analista da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG. Carlos Fasane da Silva TinocoGraduando em Ciências Biológicas, Centro Univer-sitário de Sete Lagoas – UNIFEMM.  carlosfasane@yahoo.com.br Belkiss Cristina França Silva OliveiraLicenciada em Ciências Biológicas, Centro Univer-sitário de Sete Lagoas – UNIFEMM. belkiss7l@yahoo.com.brClaudia Teixeira GuimarãesEngenheira Agrônoma, Doutora em Genética Mo-lecular, Pesquisadora da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG.  claudia@cnpms.embrapa.brJurandir Vieira de MagalhãesEngenheiro Agrônomo, Doutor em Genética Mo-lecular, Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG.  jurandir@cnpms.embrapa.brAutoresSumárioIntrodução ..........................................................................................7Objetivo ..............................................................................................7Preparo das Amostras .....................................................................8    Materiais e Equipamentos  ................................................................8     Procedimento  ...................................................................................8Extração do DNA  ...........................................................................10Materiais e Equipamentos  ...............................................................10Reagentes, Soluções e Tampões  ....................................................10Procedimento  .................................................................................10Preparo de Tampões  .....................................................................16Tampão CTAB ................................................................................16Tampão TE pH 8,0  .........................................................................16Medidas de Segurança  .................................................................17Equipamentos de Proteção (EPI e EPC)  ....................................17Descarte ...........................................................................................17Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga EscalaUbiraci Gomes de Paula Lana Priscila Cordeiro Gomes Carlos Fasane da Silva Tinoco Belkiss Cristina França Silva Oliveira Claudia Teixeira Guimarães Jurandir Vieira de MagalhãesIntroduçãoA extração de DNA vegetal de um grande número de amostras pode ser demorada e gerar um volume considerável de resíduos químicos. Esta metodologia apresenta uma estratégia de isolamento de DNA de plantas em larga escala com concentração e qualidade suficientes para diversas análises genético-moleculares. Entre suas vantagens destacam-se a necessidade de uma quantidade reduzida de tecido vegetal e a rapidez do processo, além da redução do volume de resíduos em comparação com os procedimentos tradicionais. ObjetivoEste documento apresenta a metodologia para a extração de DNA de folhas de milho e sorgo em grande escala, utilizando o triturador Geno/Grinder 2000 (Figura 1). 8 Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala           Figura 1. Imagem do triturador Geno/Grinder 2000.Preparo das AmostrasMateriais e Equipamentos- Alicate de coleta- Caixa de isopor- Freezer -80°C- Gelo- Liofilizador- Placa e tubosProcedimento- Coletar 04 discos de tecido fresco de folhas jovens por amostra com auxílio de um alicate (Figura 2).                            Figura 2. Alicate utilizado na coleta de tecido vegetal     para  extração de DNA.Foto: Carlos Fasane da Silva TinocoFoto: Carlos Fasane da Silva Tinoco9Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Colocar as amostras nos tubos específicos distribuídos em placas de capacidade para 96 amostras (Figura 3). As placas deverão permanecer dentro de uma caixa de isopor com gelo. - Tampar a placa (Figura 4).Figura 3. Tubos específicos para o triturador sem tampa (A) e com tampa (B).Figura 4. Placa tampada.- Fazer um mapa com identificação/localização das amostras e identificar a placa.- Armazenar a -80°C até o início do processo de liofilização. - Liofilizar as amostras por 48 horas. - Caso as amostras não sejam utilizadas imediatamente, armazenar novamente a -80°C até o momento da maceração e da extração.Foto: Carlos Fasane da Silva Tinoco10 Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga EscalaExtração do DNAMateriais e Equipamentos - Banho-maria- Centrífuga de placas- Capela de exaustão- Esferas de aço- Estufa - Freezer -20°C- Pipeta multicanal eletrônica- Porta-esferas- Triturador (Geno/Grinder 2000)Reagentes, Soluções e Tampões- Tampão CTAB 2% (Mistura de brometos de alquiltrimetilamônio) - ß-Mercaptoetanol p.a.- Clorofórmio-octanol 24:1 (v/v)- Isopropanol p.a. gelado a -20°C- Etanol 70% (v/v) gelado a -20°C- Tampão TE pH 8,0 (Tris-EDTA)- RNase A (10 mg/mL)Procedimento- Preparar previamente o tampão CTAB contendo ß-mercaptoetanol a 2% (m/v). Fazer os cálculos previamente de acordo com a quantidade de amostras, considerando um volume individual de tampão de 400 µL. O  ß-mercaptoetanol deverá ser adicionado na hora do uso.- Retirar as tampas e colocar esferas de aço em cada tubo contendo as amostras liofilizadas em gelo com auxílio de um porta-esferas (Figura 5) e tampar os tubos (Figura 6). - Tampar as placas.11Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Introduzir as placas no equipamento de maceração, fixando-as no suporte (Figura 7).Figura 5. Imagem do porta-esferas.Figura 6. Detalhe dos tubos para o triturador (A), as tampas (B) e os tubos tampados (C). Figura 7. Placas balanceadas fixadas no suporte do triturador.Foto: Carlos Fasane da Silva TinocoFoto: Carlos Fasane da Silva TinocoFoto: Carlos Fasane da Silva Tinoco12 Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Selecionar 1750 batidas/min (strokes/min) por 6 min (Figuras 8 e 9). A cada 2 min parar a trituração e verificar as características do tecido macerado, que deverá se tornar um pó fino e verde. Quando estas características foram atingidas pode-se interromper a trituração. Caso a maceração não tenha sido suficiente repetir este procedimento.Figura 8. Tabela com os parâmetros para maceração.Figura 9. Imagem do display do Geno/Grinder.- Retirar as tampas e tomar cuidado com as trocas de posição, pois pode haver contaminação de uma amostra para outra.- Na capela de exaustão, adicionar 400 µL de tampão de CTAB 2% (m/v), previamente preparado. Pipetar com pipeta multicanal eletrônica duas vezes de 200 µL. -	Tampar os tubos e placas. Introduzir as placas novamente no equipamento de maceração, fixando-as no suporte -  Selecionar 1750 batidas/min (strokes/min) por 10 seg.Foto: Carlos Fasane da Silva TinocoFoto: Carlos Fasane da Silva Tinoco13Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Centrifugar por 15 segundos a 4000 rpm em centrífuga de placas. Em todas as centrifugações o equipamento deverá estar balanceado (Figura 10).- Incubar as amostras em banho-maria a 65°C por uma hora. Com o objetivo de facilitar o contato térmico, remover o fundo da placa e adaptá-lo sobre as tampas dos tubos, prendendo com um elástico. A água do banho-maria deve ficar acima do volume de amostras contido nos tubos (Figura 11).Figura 10. Centrífuga de placas balanceada.Figura 11. Amostras incubadas em banho-maria.- Homogeneizar a cada 10 min, agitando levemente. Atenção: evitar a agitação por inversão.Foto: Carlos Fasane da Silva TinocoFoto: Carlos Fasane da Silva Tinoco14 Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Retirar a placa do banho-maria e resfriar na capela de exaustão por 5 minutos.- Centrifugar, por 15 segundos a 4000 rpm em centrífuga de placas. - Retirar as tampas das amostras na capela de exaustão. Cuidado para não haver troca de tampas entre as amostras. Atenção: nesta etapa pode haver projeção de líquido. - Adicionar 300 µL de clorofórmio-octanol 24:1 (v/v). Pipetar com pipeta multicanal eletrônica duas vezes de 150 µL.- Tampar os tubos e as placas. Colocar um papel toalha entre os tubos tampados e a tampa da placa (Figura 12).Figura 12. Placas prontas para homogeneização por inversão.- Homogeneizar cuidadosamente a placa por inversão cerca de 30 vezes. - Centrifugar por 5 min a 2500 rpm.- Na capela de exaustão, retirar as tampas e tomar o cuidado para não trocá-las entre as amostras.- Retirar o sobrenadante com a pipeta multicanal eletrônica e transferir para outra placa contendo tubos e tampas novos. O volume retirado nesta etapa deverá ser em torno 200 µL, pois pode variar entre as amostras. Ao retirar o sobrenadante, tomar o cuidado para não contaminá-lo com o precipitado.- Ao sobrenadante, adicionar 300 µL de isopropanol p.a. gelado a -20°C. Pipetar com pipeta multicanal eletrônica duas vezes de 150 µL (Figura 13).Foto: Carlos Fasane da Silva Tinoco15Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Tampar os tubos e as placas. Colocar papel toalha entre os tubos tampados e a tampa das placas (Figura 12).- Homogeneizar a placa por inversão cerca de 15 vezes. - Incubar a -20°C por uma hora.- Centrifugar por 15 min a 4000 rpm.- Retirar as tampas e tomar o cuidado para não trocá-las entre as amostras.- Cuidadosamente, descartar o sobrenadante por inversão, removendo individualmente cada tubo. Remover o excesso de líquido invertendo os tubos brevemente sobre papel toalha. OBS.: Caso seja possível a visualização de precipitado, o descarte deverá ser realizado do lado contrário do precipitado. Caso o precipitado não esteja preso ao fundo do tubo, repetir a última etapa de centrifugação.- Ao precipitado, adicionar 300 µL de etanol 70% (v/v) gelado a -20°C. Pipetar com pipeta multicanal eletrônica duas vezes de 150 µL.- Tampar os tubos e as placas.- Centrifugar a 4000 rpm por 5 min.- Cuidadosamente, descartar o sobrenadante por inversão, removendo individualmente cada fileira (oito tubos). Remover o excesso de etanol invertendo os tubos brevemente sobre papel toalha.- Secar na estufa a 65°C até a evaporação completa do etanol. Nesta etapa, o precipitado ficará mais visível. Este processo não deverá demorar mais que 5 min. Figura 13. Uso da pipeta multicanal eletrônica.Foto: Carlos Fasane da Silva Tinoco16 Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga Escala- Ressuspender cada amostra com 100 µL de TE pH 8,0 contendo 0,2 µL de RNase A (10 mg/mL). Se necessário, pode-se agitar brevemente em vortex.-	Tampar os tubos, as placas e armazenar a -20°C.-	Normalmente, a concentração final média de DNA é de 150 ng/µL.Preparo de TampõesTampão CTAB 2% (m/v)- Medir 470 mL de H2O deionizada utilizando-se uma proveta de 500 mL.- Medir 200 mL de Tris-HCl 1 mol/L pH7,5 utilizando-se uma proveta de 500 mL.- Transferir para um béquer de 1000 mL.- Adicionar 280 mL de solução de NaCl 5 mol/L medidos em proveta de 500 mL.- Adicionar 40 mL de EDTA 0,5 mol/L pH 8,0 medidos em proveta de 100 mL.- Adicionar, sob intensa agitação, 20 g de CTAB. - Agitar até completa dissolução e armazenar a 4°C em frasco devidamente identificado até o momento do uso.Tampão TE pH 8,0- Medir 10 mL de Tris-HCl 1 mol/L pH 8,0 em pipeta graduada.- Medir 2 mL de EDTA 0,5 mol/L pH 8,0 em pipeta graduada.- Transferir para um balão volumétrico de 1000 mL contendo aproximadamente 600 mL de água ultrapura.- Acertar o volume para 1000 mL.- Armazenar a 4°C em frasco devidamente identificado até o momento do uso.17Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para Extração de DNA de Tecido Vegetal em Larga EscalaMedidas de SegurançaO ß-mercaptoetanol é uma substância tóxica e de odor desagradável. Todas as etapas de manipulação deverão ser realizadas na capela de exaustão de gases. É obrigatório o uso de EPI (equipamento de proteção individual) e EPC (equipamento de proteção coletiva).Equipamentos de Proteção (EPI e EPC)Guarda-pó de manga longa, sapatos fechados, óculos de segurança, luvas de látex, capela de exaustão de gases.DescarteTodas as ponteiras e microtubos contaminados com b-mercaptoetanol e clorofórmio deverão ser descartados em lixo apropriado e identificado, localizado na capela de exaustão. 

Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para extração de DNA de tecido vegetal em larga escala.

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Procedimento da Embrapa Milho e Sorgo para extração de DNA de tecido vegetal em larga escala.

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