BONATO, A. L. V.

JANK, L.

LEGUIZAMON, G. O. de C.

RESENDE, R. M. S.

VALLE, C. B. do

Portuguese

Infoteca-e

Extração de DNAGenômico de Brachiaria ePanicum maximumAna Lídia Variani Bonato1Cacilda Borges do Valle2Liana Jank3Rosângela Maria Simeão Resende4Gisele Olivas de C. Leguizamon579ISSN 1516-9308Campo Grande, MSDezembro, 20021 Enga.-Agra., Ph.D., CREA No 78.233, Embrapa Gado de Corte, Rodovia BR 262, Km 4, Caixa Postal 154, CEP 79002-970 Campo Grande, MS. Correioeletrônico: analidia@cnpgc.embrapa.br2 Enga.-Agra., Ph.D., CREA No 35.409/D-Visto 1.542/MS, Embrapa Gado de Corte. Correio eletrônico: cacilda@cnpgc.embrapa.br3 Enga.-Agra., Ph.D., CREA No 100.219/D-Visto 2.733/MS, Embrapa Gado de Corte. Correio eletrônico: liana@cnpgc.embrapa.br4 Biól., D.Sc., CRBio 17.718-03D 3a Região, Embrapa Gado de Corte. Correio eletrônico: rosangela@cnpgc.embrapa.br5 Laboratorista, Embrapa Gado de Corte. Correio eletrônico: gisele@cnpgc.embrapa.brIntroduçãoAs pastagens cultivadas de gramíneas são a base daprodução de carne e leite no Brasil, mas o número reduzidode cultivares disponíveis faz dessa baixa diversidade omaior fator de risco para o sistema de produção. A exemplodisso, duas cultivares de gramíneas forrageiras do gêneroBrachiaria respondem por cerca de 50% das áreas depastagens estabelecidas no Brasil e 85% das sementesforrageiras comercializadas no Brasil Central, representandoum extenso monocultivo.As braquiárias alcançaram grande importância econômica noBrasil nos últimos trinta anos por viabilizar a atividadepecuária nos solos fracos e ácidos dos cerrados, criandonovos pólos de desenvolvimento e colonização no BrasilCentral.Na Embrapa Gado de Corte, os trabalhos com Brachiariaforam intensificados a partir de 1987 quando uma grandecoleção introduzida da África, via Centro Internacional deAgricultura Tropical − CIAT − foi disponibilizada à Embrapa.A coleção conta com 446 acessos em 13 espécies diferen-tes (Valle & Savidan, 1996). A avaliação dessa coleçãoincluiu tanto características básicas – como níveis de ploidiae determinação do modo de reprodução – quanto caracterís-ticas agronômicas de produtividade e resistência ao principalinseto praga que é a cigarrinha-das-pastagens. Acessossuperiores foram identificados e encontram-se em fase finalde avaliação. Híbridos foram gerados no programa demelhoramento, envolvendo cruzamentos interespecíficos, eestão sob avaliações genéticas e agronômicas. O uso demarcadores moleculares para a detecção da natureza híbridadas progênies, do modo de reprodução e também para oestudo da diversidade genética existente na coleção devetornar o programa de melhoramento mais eficiente.A espécie Panicum maximum Jacq. ocupa posição dedestaque na pecuária brasileira por incluir gramíneas deelevada produção e qualidade, ser de fácil propagação porsementes e ser altamente palatável ao gado.2 Extração de DNA genômico de Brachiaria e Panicum maximumDesde 1984, a Embrapa Gado de Corte vem desenvolvendotrabalhos de seleção e melhoramento da espécie, tendolançado três cultivares no mercado até o momento, comgrande aceitação pelos pecuaristas. A partir da coleçãointroduzida, de mais de 400 acessos apomíticos da espécie,vários foram selecionados por suas características agronômi-cas e morfológicas e são considerados promissores, entreos quais, 25 foram avaliados em 7 regiões do País em umarede nacional de ensaios (Savidan et al., 1990; Jank et al.,1993). Dos resultados desta avaliação, sete acessos foramescolhidos e avaliados em pequenas parcelas sob pastejo(Euclides et al., 1995), e posteriormente os melhores emensaios de desempenho animal. O conjunto destas e deoutras avaliações, como de resistência às cigarrinhas-das-pastagens e resposta à fertilidade dos solos, levou aolançamento das cultivares Tanzânia-1 em 1990, Mombaçaem 1993 e Massai em 2001. A despeito destas explora-ções, o germoplasma de P. maximum ainda dispõe de váriosacessos promissores e não avaliados em rede nacional.Além disso, pode servir de fonte de genes no melhoramentogenético da espécie. Por este motivo, o germoplasmanecessita ser bem caracterizado e conservado.Atualmente várias técnicas que geram marcadoresmoleculares estão disponíveis e estão sendo empregadaspara a caracterização de germoplasma. Aliadas à identifica-ção de acessos superiores do ponto de vista agronômico,elas contribuem para os programas de melhoramentogenético.O produto utilizado nas análises genéticas realizadas combase em marcadores moleculares é o DNA (ácidodesoxirribonucléico). Sendo assim, a eficiência destasanálises é essencialmente dependente da qualidade e daquantidade do DNA extraído. Em plantas, vários fatorespodem influenciar estas características, incluindo desde osprocedimentos para a coleta e armazenamento do tecidovegetal até o processo de extração de DNA e dearmazenamento do DNA extraído.Vários métodos de extração de DNA de plantas têm sidodescritos na literatura. A maior parte deles, entretanto, éuma variação de dois protocolos básicos, dentre eles ofundamentado na utilização do detergente brometo decetiltrimetilamônio − CTAB (Doyle & Doyle, 1987, citadospor Romano, 1998) é citado como o mais utilizado para aextração de diferentes espécies vegetais (Romano, 1998).Basicamente, os protocolos são utilizados com algumasmodificações visando solucionar problemas intrínsecos daespécie analisada (Ferreira & Grattapaglia, 1996).Os objetivos deste documento são descrever a metodologiade extração de DNA genômico, ajustada para Brachiaria e P.maximum, a partir do protocolo utilizado por Saghai-Marrofet al. (1984) baseado na utilização de CTAB e tecerMetodologia• Pesar aproximadamente 300 mg de tecido foliarfresco.• Macerar com nitrogênio liquido, cuidando para otecido não descongelar.• Adicionar às amostras 900 µL de tampão de extraçãoCTAB (Tabela 1) pré-aquecido a 65°C e misturarbem.• Incubar as amostras a 65°C em banho-maria por 60-90 minutos, invertendo os tubos, gentilmente, a cada10 minutos.• Retirar do banho-maria e deixar esfriar em temperaturaambiente por 5 minutos.• Adicionar 450 µL de clorofórmio-álcool isoamílico(24:1). Inverter gentilmente por 10 minutos.• Centrifugar a 4.500 g por 10 minutos à temperaturaambiente.• Coletar o sobrenadante e transferir para novos tubos.Repetir os passos 6 e 7.• Coletar o sobrenadante e transferir para novos tubos eadicionar 600 µL de isopropanol (-20°C).Homogeneizar para precipitar o DNA, e/ou,• Incubar a -20°C por 30 minutos.• Centrifugar a 10.000 g por 5 minutos à temperaturaambiente.• Retirar o sobrenadante e deixar o pellet.• Suspender em 400 µL do tampão TE (Tris-EDTA).Obs: Pode-se interromper o processo nessa etapa,armazenando a amostra a 4°C durante a noite.• Precipitar o DNA adicionando primeiro: 20 µL de NaCl5M (p/ 400 µL) e, em seguida, 800 µL de etanolabsoluto.• Inverter gentilmente os tubos até precipitar o DNA.• Centrifugar a 10.000 g por 5 minutos à temperaturaambiente.• Lavar o pellet com 400 µL de etanol 70% (-20°C).• Descartar o etanol 70% e deixar secar à temperaturaambiente.• Suspender o pellet em TE: 50 ou 100 µL.• Adicionar 3 µL de RNAse (10 mg/mL). Misturar eincubar por 30 minutos a 37°C.• Armazenar as amostras a -20°C.considerações sobre as etapas do processo, observadasespecificamente para essas gramíneas forrageiras.3 Extração de DNA genômico de Brachiaria e Panicum maximumTabela 1. Tampão de extração CTAB.Componentes Volume final (10 mL)CTAB 5%NaCl 5 MTris-HCl 1M pH 8,0EDTA 0,5 MÁgua destilada2-mercaptoetanolPolivinilpirrolidone (PVP)4,0 mL2,8 mL1,0 mL0,4 mL1,6 mL0,04 mL0,1 gConsiderações geraisPara o procedimento de amostragem do tecido foliar, indica-se preferencialmente a coleta de tecido novo, onde ocorre afase ativa de crescimento das plantas. No entanto, paraBrachiaria e P. maximum, pode-se também coletar materialfoliar adulto, pois é possível realizar a extração do DNAnormalmente sem comprometimento da qualidade. Nestescasos, o DNA é de boa qualidade, sem oxidação que podesignificar contaminação com polifenóis que se oxidam emcompostos quinônicos e sem degradação causada porcontaminação com DNAses endógenas.É possível extrair DNA de qualidade dessas espécies tanto apartir de material foliar fresco, processadas logo após acoleta,  quanto a partir de tecidos armazenados a -20°C poraproximadamente um mês.Considerando que para a técnica de RAPD somente algunsmiligramas de tecido fresco são suficientes para gerar aquantidade necessária de DNA, o protocolo foi adaptadopara realização em microtubos (2,0 e 1,5 mL) o que reduz ogasto de reagentes e o custo por amostra.Na maceração mecânica, onde há o rompimento das paredese membranas celulares do tecido, deve-se cuidar paramanter as folhas congeladas pela adição de nitrogêniolíquido. Em etapa seguinte, o tecido macerado éressuspendido em um tampão de extração, contendo odetergente catiônico CTAB, para solubilizar as membranasprotéicas. Para a solubilização e ação do CTAB, é adiciona-da uma concentração de 1,4M NaCl e é utilizado umsistema Tris-HCl pH 8,0 para manutenção do pH constante.Outros componentes desse tampão visam proteger o DNAda ação de enzimas nativas ou compostos secundáriosliberados com o rompimento das células. O EDTA(etilenodiaminotetracetato) quela cátions divalentes taiscomo Mg2+ e Ca2+. O PVP (polivinilpirrolidone) tem umefeito antioxidante. O 2-mercaptoetanol é um agente redutorque desnatura proteínas como peroxidases epolifenoloxidases.Após o processamento com  o tampão de extração, omaterial é submetido a uma extração com solvente orgânico,clorofórmio-álcool isoamílico, seguida de centrifugação paraseparação da fase orgânica da fase aquosa. Na fase orgâni-ca, que fica na parte inferior da solução, são retidos edescartados os lipídeos, proteínas e alguns polissacarídeos.Na fase aquosa, ficam o DNA e alguns contaminantes comoRNA e alguns polissacarídeos. Esta etapa é repetida parapurificar o DNA dos contaminantes, diferente do protocolooriginal que faz esta purificação apenas uma vez. Posterior-mente, na presença de um sal e de um álcool, o DNA érapidamente precipitado e, então, sedimentado porcentrifugação. Seguem-se a lavagem do DNA com etanol70% e a secagem à temperatura ambiente.Finalmente, o DNA é suspenso em um tampão TE (Tris-EDTA), onde permanecerá armazenado na forma concentra-da. A diluição para uma solução de trabalho é feita comágua miliQ.Esses procedimentos foram realizados com sucesso para asduas gramíneas forrageiras, Brachiaria e P. maximum, e,possivelmente, podem ser testadas às demais espécies egêneros de gramíneas forrageiras tropicais.Referências bibliográficasEUCLIDES, V. P. B.; MACEDO, M. C. M.; OLIVEIRA, M. P.de. Avaliação de ecotipos de Panicum maximum sob pastejoem pequenas parcelas. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDA-DE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 32., 1995, Brasília.Anais... Brasília: SBZ, 1995. p. 97-99.FERREIRA, M. 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Brasília: Embrapa-SPI:Embrapa-Cenargen, 1998. p. 163-189.4 Extração de DNA genômico de Brachiaria e Panicum maximumExemplares desta edição podem ser adquiridos na:Embrapa Gado de CorteEndereço: Rodovia BR 262, km 4, Caixa Postal 15479002-970 Campo Grande, MSFone: (67) 368 2083Fax: (67) 368 2180E-mail: publicacoes@cnpgc.embrapa.br1a edição1a impressão (2002): 500 exemplaresComitê depublicaçõesExpedienteComunicadoTécnico, 79Ministério da Agricultura,Pecuária e AbastecimentoPresidente: Cacilda Borges do ValleSecretário-Executivo: Liana JankMembros: Antonio do Nascimento Rosa, Arnildo Pott,Ecila Carolina N. Z. Lima, Ezequiel R. do Valle, JoséRaul Valério, Maria Antonia M. de U. Cintra,Rosângela Maria S. Resende, Tênisson W. de SouzaSupervisor editorial: Ecila Carolina N. Z. LimaRevisão de texto: Sylvia Odinei CescoEditoração eletrônica: Ecila Carolina N. Z. LimaSAGHAI-MAROOF, M. A.; SLOMAN, K. M.; JORGENSEN,R. A.; ALLARD, R. W. Ribossomal DNA spacer-lengthpolymorphisms in barley: Mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics.Proceedings of  National Academy of  Science of USA,Washington, v. 81, p. 8014-8018, 1984.SAVIDAN, Y. H.; JANK, L.; COSTA, J. C. G. Registro de25 acessos selecionados de Panicum maximum. CampoGrande, EMBRAPA-CNPGC, 1990. 68 p. (EMBRAPA-CNPGC. Documentos, 44).VALLE, C. B.; SAVIDAN Y. H. Genetics, cytogenetics andreproductive biology of Brachiaria. In: MILES, J. W.;MAASS, B. L.; VALLE C. B. (Ed.). Brachiaria: biology,agronomy, and improvement. Cali: CIAT/Brasília:EMBRAPA-CNPGC, 1996. p. 147-163.

Extração de DNA genômico de Brachiaria e Panicum maximum.

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