MARTIN NETO, L.

MILORI, D. M. B. P.

TERENCIO, J. C. C.

Infoteca-e

11ISSN 1517-1981Outubro 2000Identificação de Morte Súbita dosCitros Usando Espectroscopia deFluorescênciaN 1678-0434Novembro, 2 5 República Federativa do BrasilLuiz Inácio Lula da SilvaPresidenteMinistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPARoberto RodriguesMinistroEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EmbrapaConselho de AdministraçãoLuis Carlos Guedes PintoPresidenteSilvio CrestanaDiretor-PresidenteAlexandre Kalil PiresErnesto PaternianiHélio TolliniCláudia Assunção dos Santos ViegasMembrosDiretoria Executiva da EmbrapaSilvio CrestanaDiretor-PresidenteJosé Geraldo Eugênio de FrançaKepler Euclides FilhoTatiana Deane de Abreu SáDiretoresEmbrapa Instrumentação AgropecuáriaLadislau Martin NetoChefe GeralCarlos Manoel Pedro VazChefe Adjunto de Pesquisa e DesenvolvimentoMaria do Socorro Gonçalves de Souza MonzaneChefe Adjunto de AdministraçãoRicardo Yassushi InamasuGerente da Área de Comunicação e NegóciosISSN 1678-0434Novembro, 2005Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaMinistério da Agricultura e do AbastecimentoEmbrapa Instrumentação Agropecuária 11São Carlos, SP2005Jean Carlos Corte TerencioDébora Marcondes Bastos Pereira MiloriLadislau Martin-NetoIdentificação de Morte Súbita dosCitros Usando Espectroscopia deFluorescênciaExemplares desta publicação podem ser adquiridos na:Embrapa Instrumentação AgropacuáriaRua XV de Novembro, 1452Caixa Postal 741CEP 13560-970 - São Carlos-SPFone: (16) 3374 2477Fax: (16) 3372 5958www.cnpdia.embrapa.brE-mail: sac@cnpdia.embrap.brComitê de Publicações da UnidadePresidente: Dr. Carlos Manoel Pedro VazSecretária-Executiva: Valéria de Fátima CardosoMembros: Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,Dr. João de Mendonça Naime,Dr. Washington Luiz de Barros MeloMembro Suplente: Dr. Paulo Sérgio de Paula Herrmann JuniorSupervisor editorial: Dr. Victor Bertucci NetoRevisor de texto: Dr. Victor Bertucci NetoNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoTratamento de ilustrações: Valentim MonzaneCapa: Foto arquivoEditoração eletrônica: Valentim Monzanea1  ediçãoa1  impressão (2005): tiragem 300Todos os direitos reservados.A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte,oconstitui violação dos direitos autorais (Lei n  9.610).CIP-Brasil. Catalogação-na-publicação.Embrapa Instrumentação AgropecuáriaTerencio, Jean Carlos Corte     Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopia deFluorescência / Jean Carlos Corte Terencio, Débora Marcondes BastosPereira Milori, Ladislau Martin-Neto. -- São Carlos: Embrapa InstrumentaçãoAgropecuária, 2005.     11 p.  (Embrapa Instrumentação Agropecuária. Boletim de Pesquisa eDesenvolvimento, ; 11)     1. Citros  Porta enxerto. 2. Fitopatologia. 3. Fluorescência. I. Milori,D. M. B. P. II. Martin-Neto, L. III. Título. IV. Série.CDD 21 ED 634.304ISSN 1678-0434                                                                         © Embrapa 2005T316iSumárioResumo ..............................................................5Abstract .............................................................6Introdução ..........................................................7Material e Métodos .............................................8Resultados e Discussão .......................................9Conclusões .......................................................10Referências Bibliográficas ...................................10ResumoA morte súbita dos citros (MSC) já causou desde 1999 o definhamento e morte de mais de 1,5 milhão de árvores de laranjeira podendo atingir 85% dos pomares paulistas e mineiros. O agente causal da doença ainda permanece desconhecido. A forma de detecção atual da doença é feita através de inspeção visual da árvore, cujos sintomas às vezes se assemelham muito com outras doenças causando muita incerteza na produção de laudos de infestação da doença. Um amarelecimento que a doença causa na parte interna do porta enxerto é o critério mais forte para o diagnóstico final, entretanto o procedimento leva a uma grande lesão na planta que pode servir para a entrada de outras doenças em árvores ainda não infectadas. Este trabalho propõe identificar plantas contaminadas por Morte Súbita dos Citros utilizando a técnica de fluorescência visando aumentar a precisão na detecção da doenças. Esta metodologia também permite a detecção da doença precocemente possibilitando a tomada de decisões que possam minorar as perdas de produção para os citricultores.palavras-Chave:.Citros; Porta-enxerto; Fitopatologia; Fluorescência1 e-mail: jean@cnpdia.embrapa.br2Física, Dra., Embrapa Instrumentação Agropecuária, Caixa Postal 741, CEP 13560-970, São Carlos-SP,e-mail: debora@cnpdia.embrapa.br3Físico, Dr., Embrapa Instrumentação Agropecuária, Caixa Postal 741, CEP 13560-970, São Carlos-SP,e-mail: martin@cnpdia.embrapa.brMSc em Química Analítica, Universidade de São Paulo, Identificação de Morte Súbita dosCitros Usando Espectroscopia deFluorescênciaJean Carlos Corte TerencioDébora Marcondes Bastos Pereira MiloriLadislau Martin-Neto123AbstractThe sudden death of citros (SDC) desease caused since 1999 the consumption and death of more than 1,5 million of orange trees in Brazil, being able to reach 85% of the São Paulo and Minas Gerais orchards. The causal agent of disease is still  unknown. The current manner of disease detection is made through visual inspection of the orange trees, whose symptoms are very similar to others diseases, causing uncertainty in the production of infestation awards. A yellowish in the internal part of stem, typical of disease, is the strongest  criterion for the final diagnosis, however leads to a great injury in the plant that can serve for the entrance of other diseases in trees still not infected. This work intends to identify contaminated plants by Sudden Death of  Citros using the fluorescence spectroscopy technique. The goal is to increase the precision in the diagnosis. This methodology also allows the precocious detention of the disease making possible a quick taking of decisions, diminishing losses for the citrus producers.Key-words:Citrus; Rootstock; Phytopathology; Fluorescence. Diagnosis of Citrus SuddenDeath Using FluorescenceSpectroscopyJean Carlos Corte TerencioDébora Marcondes Bastos Pereira MiloriLadislau Martin-NetoIntroduçãoAssistimos ao final do último século a descoberta de uma doença denominada de MSC que afeta os pomares de laranjeiras doces [Citrus sinensis (L.) Osbeck] 'Valência', 'Hamlin', 'Natal', 'Westin' e 'Pera' e tangerineiras (C. reticulata Blanco) 'Cravo' e 'Ponkan' enxertadas sobre limoeiro 'Cravo' (C.limonia Osbeck). Bassanezi et al. (2003) descreve o prelúdio da doença, como sendo relatada em três municípios do Estado de Minas Gerais e quatro do Estado de São Paulo (GIMENES-FERNANDES e BASSANEZI, 2001). A MSC está associada à combinação laranjeira doce sobre limoeiro 'Cravo', uma vez que combinações de laranjeiras doces sobre porta-enxertos de tangerineiras 'Cleópatra' (C. reshni Hort. ex Tan.) e 'Sunki' (C. sunki Hort. ex Tanaka), Poncirus trifoliata (L.) Raf. e citrumelo 'Swingle' [P. trifoliata (L.) Raf. X C. paradisi Macf.] são resistentes aos sintomas da doença como descreve  Gimenes-Fernandes et al. (2002).Inicialmente, a copa da planta afetada apresenta perda de brilho das folhas, poucas brotações, ausência de brotações internas e desfolha parcial. O sistema radicular apresenta grande quantidade de raízes podres e mortas, com poucas radicelas. O sintoma característico da doença é o amarelecimento do tecido interno da casca do porta-enxerto abaixo da região da enxertia podendo, em alguns casos, ficar alaranjado, contrastando com a coloração creme dos tecidos da casca da copa. Este tecido amarelado corresponde, na maior parte, aos vasos do floema que se encontram obstruídos e degenerados como descrevem Gimenes-Fernandes e Bassanezi (2001). Todo este quadro sintomatológico pode ocorrer rapidamente, de um a mais de doze meses, dependendo da época do ano e da condição de produção da planta (BASSANEZI et al., 2002). Até o momento, nenhuma planta com menos de 22 meses, em pomares na região com maiores incidências da doença, apresentou sintomas.Até o momento, nenhum patógeno foi confirmado como agente biótico da MSC, mas a hipótese mais provável é, segundo a Alellyx Applied Genomics (2005),  que a MSC seja causada por uma associação de um vírus da família Tymoviridae, chamado de citrus sudden death-associeted virus com CSDav, transmitido pelo pulgao preto dos citros Toxptera citricida (MACCHERONI et al; 2005), de maneira semelhante à tristeza dos citros na sua forma de declínio rápido, quando a laranjeira doce é enxertada sobre laranjeira 'Azeda' (C.aurantium L.). A forma de detecção atual da doença é feita através de inspeção visual da árvore, cujos sintomas às vezes se assemelham muito com os de outras doenças, como por exemplo o Declínio dos Citros, causando muita incerteza na7Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopiade Fluorescênciaprodução de laudos de infestação. O amarelecimento da parte interna do porta enxerto é o critério mais forte para o diagnóstico final, entretanto leva a uma grande lesão na planta que pode servir para a entrada de outras doenças em árvores ainda não infectadas. Este trabalho propõe identificar plantas contaminadas pela MSC utilizando a técnica de espectroscopia de fluorescência visando aumentar a precisão na detecção da doenças e diminuir lesão na planta. A idéia básica do método é que a doença leva a alterações químicas no tecido do porta-enxerto, e consequentemente deve levar a alterações da emissão de fluorescência do material. Portanto, a metodologia deve permitir a detecção da doença precocemente, antes de sintomas externos da planta, possibilitando a tomada de decisões rápidas que possam minorar as perdas de produção para os citricultores.Material e MétodosA pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Óptica e Lasers pertencente a Embrapa Instrumentação Agropecuária, localizada no município de São Carlos  SP, durante o período de agosto de 2004 a outubro de 2005.O procedimento experimental baseou-se, inicialmente, na retirada de pedaços do porta-enxerto de laranjeiras doce tanto  nas variedades Pêra-Rio quanto na Valência enxertadas sobre limão 'cravo' [ Citrus limonia (L.) Osbeck] plantadas há 14 anos e 19 anos respectivamente. Estas amostras foram enviadas pelo Fundecitrus - Fundo de Defesa da Citricultura e divididas em sadias, com morte súbita dos citros e com declínio dos citros. As plantas de laranjeiras doces apresentavam medidas semelhantes quanto a variedade da copa/cavalo, tamanho da copa, diâmetro do caule e idade. Foram analisadas 166 amostras de porta-enxertos entre saudáveis, doentes com Morte Súbita dos Citros e com Declínio dos Citros certificadas pelos técnicos da Fundecitrus. Foram retiradas lâminas do material interno dos porta-enxertos para as análises de espectroscopia de fluorescência em um equipamento Shimadzu, modelo RF-5301PC pertencente à Embrapa Instrumentação Agropecuária. Inicialmente o material foi caracterizado através de seus espectros de emissão e excitação. Todas as medidas foram realizadas com fendas de excitação e emissão de  5 nm, velocidade de varredura média e sem  a utilização de filtros. Através das diferenças espectrais observadas por esta caracterização foi gerado um índice de identificação para material saudável, com morte súbita e com declínio.8Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopiade FluorescênciaResultados e DiscussãoApós um minucioso estudo das características dos espectros de emissão e excitação dos porta-enxertos, observou-se que a excitação em 576 nm fornecia espectros de emissão onde eram visualizadas as maiores diferenças espectrais entre os materiais saudáveis e doentes, como mostra a Fig. 1.Tomando como referência a banda com máximo em 822 nm, observou-se que os materiais doentes e saudáveis apresentavam níveis de emissão em 629 nm bastante diferenciados. Baseados nesta observação foi proposto um índice que é a razão entre as intensidades de emissão em 629 nm e 822 nm.(1)Para os 166 porta-enxertos analisados, valores de I  acima de 6,4 ccorrespondiam a plantas com MSC. Os porta-enxerto saudáveis e com declínio apresentavam sempre valores inferiores, mas através desta metodologia não foi possível diferenciar com muita precisão árvores saudáveis e árvores com declínio. Quanto a diferenciação entre árvores com MSC e saudáveis a precisão foi de aproximadamente 87%. Este resultado pode ser visualizado na Fig. 2.Fig. 1. Espectro de Emissão de Fluorescência com Excitação em 576 nm típicos de amostras com morte súbita dos citros, sadias e declínio dos citros.9Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopiade Fluorescência550 600 650 700 750 800 850 900-1000100200300400500600700Intensidade(u.a.)λ (nm) MSC Saudável DeclínioFig. 2. Identificação de materiais saudáveis e doentes através de I .cConclusãoA metodologia desenvolvida por este trabalho deve auxiliar na inspeção visual, realizada pelos técnicos do Fundecitrus, dando-lhes maior precisão no diagnóstico e diminuição da lesão na árvore, pois para sonda de análise pode ser utilizado fibras ópticas. Considerando como referência a inspeção visual o método forneceu uma porcentagem de acerto bastante elevada, em torno de 90%. Este valor pode ser ainda maior considerando que plantas em estágio precoce da doença, que a inspeção visual não consegue avaliar, podem ter gerado erro na referência. O desafio agora é montar um sistema de fluorescência portátil que se adeqüe a metodologia desenvolvida e sirva para a realização de avaliações em campo. Referências BibliográficasBASSANEZI, R. B.; BERGAMIN, A.; AMORIM, L. et al. Spatial and temporal analyses of citrus sudden death as a tool to generate hypotheses concerning its etiology. Phytopathology, St. Paul., v. 93, n. 4, p. 502-512, 2003.BASSANEZI, R. B.; YAMAMOTO, P. T.; GIMENES-FERNANDES, N. Progresso dos sintomas da ' morte súbita' em pomares de laranjeiras ' Valencia e Pêra. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 28, p. 23, 2002. Resumo.10Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopiade Fluorescência0 10 20 30 40 50 60 70 80-50510152025303540 MSC Sadias DeclínioIntensidade(u.a)Nº de AmostrasDERRICK, K.S.; BERETTA, M. J.; BARTHE, G. A. et al. Identification of strains of Citrus tristeza virus by subtraction hybridization. Plant Disease; An International Journal of Applied Plant Pathology, St. Paul., v. 87, n. 11, p. 1355-1359, 2003.GIMENES-FERNANDES, N.; BASSANEZI, R. B. Doença de causa desconhecida afeta pomares cítricos no norte de São Paulo e sul do Triangulo Mineiro. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 28, p. 72, 2001. Resumo.GIMENES-FERNANDES, N.; BASSANEZI, R. B.; YAMAMOTO, P. T.; AYRES, A. J. Árvores de limoeiro 'Cravo' não mostram sintomas de ' morte súbita' em área afetada. Summa Phytopathologica, Jaguariúna, v. 28, p. 72, 2002. Resumo.MACCHERONI, W.;/ ALEGRIA, M. C.; GREGGIO, C. C. et al. Identification and genomic characterization of a new virus (Tymoviridae family) associated with citrus sudden death disease. Journal of Virology, Washington, DC, v. 79, n. 5, p. 3028-3037, 2005.ROMAN, M.P.; CAMBRA, M.; JUAREZ, J. et al. Sudden death of citrus in Brazil: A graft-transmissible bud union disease. Plant Disease; An International Journal of Applied Plant Pathology, St. Paul., v. 88, n. 5, p. 453-467, 2004.  11Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopiade Fluorescência

Identificação de Morte Súbita dos Citros Usando Espectroscopia de Fluorescência.

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