COLETA FILHO, H. D.

COLNAGO, L. A.

MACHADO, M. A.

OSIRO, D.

Infoteca-e

oN  40, out/2000, p.1-5USO DE FTIR PARA ANÁLISE DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DO CANCRO CÍTRICO E CVC1Denise Osiro2Helvécio Della Coleta Filho2Marcos Antônio Machado3Luiz Alberto ColnagoIntroduçãoA espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) é uma das espectroscopias vibracionais cujas bandas espectrais são função da força das ligações químicas e das massas dos átomos envolvidos nessas ligações. Por isso é extremamente útil para a identificação de componentes de moléculas orgânicas como os grupos O-H, N-H, C=O, C-N, C-O etc, que são os principais constituintes das  proteínas, açúcares, DNA, ácidos graxos, entre outras moléculas. As aplicações de FTIR em biologia envolvem tanto os estudos das estruturas de DNA, proteínas e polissacarídeos in vitro quanto as  aplicações como a avaliação da composição química de bactérias e tecidos animais e vegetais in vivo (Mantsch & Chapman, 1996). Como os polissacarídeos exacelulares das bactérias Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv citri , causadoras da clorose variegada dos citrus (CVC) e cancro cítrico respectivamente, são considerados os fatores de patogenicidade dessas bactérias, apresenta-se neste trabalho uma metodologia com o uso da espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) para análise desses polissacarídeos. As bactérias Xylella fastidiosa e Xanthomonas axonopodis pv citri foram cultivadas no meio PW e M9, respectivamente. As culturas permaneceram sob agitação constante a 28ºC. As culturas de Xanthomonas e Xylella foram centrifugadas a 4000rpm por 20 minutos, em seguida, o precipitado contendo a  bactéria foi suspenso em solução de NaCl 0,05% e uma nova centrifugação foi feita  a  fim  de  remover  resíduos  do  meio  de  cultura.   O  precipitado  final  foi novamente¹Instituto de Química de São Carlos - USP²Instituto Agronômico de Campinas3Embrapa Instrumentação Agropecuária, Cx Postal 741, CEP 13560-970, São Carlos-SPISSN  1413-6244COMUNICADOTÉCNICOMinistério da Agricultura e do Abastecimento Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaCentro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Instrumentação AgropecuáriaRua XV de Novembro, 1452 - Caixa Postal 741 - CEP 13560-970 - São Carlos - SPTelefone: (16) 274 2477 - Fax: (16) 272 5958 - e-mail: postmaster@cnpdia.embrapa.brCOMUNICADO TÉCNICOCT/40, CNPDIA, out/2000, p.2suspendido em solução de NaCl 0,05%. A solução salina contendo a bactéria foi depositada em janela de silício e  após  a  secagem,  foi  analisada  em um espectrômetro de FTIR Paragon 1000. Os espectros foram coletadas com um total de -1 -116 varreduras, com uma resolução espectral de 4cm , de 4000 a 400cmFigura 1- Espectros de FTIR da proteína lisozima (A), da goma xantana (B) e da bactéria Xanthomonas em diferentes tempos de crescimento (C, D, E e F).Na figura 1 estão os espectros de FTIR da bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri em diferente tempo de crescimento, um espectro típico de proteína (lisozima)  e um espectro da goma xantana que é principal polissacarídeos das bactérias do gênero   Xanthomonas.  As  bandas  mais  intensas  do  espectro  das  proteínas  são COMUNICADO TÉCNICOCT/40, CNPDIA, out/2000, p.3devido principalmente aos grupo peptídicos.  A banda intensa, larga e centrada em -13300cm  é devido principalmente  ao estiramento do grupo NH (amida A). As bandas -1 -1intensas entre 1700 e 1600 cm  e entre 1600 e 1500 cm , são conhecidas como bandas de amida I e amida II. A banda de amida I é devido principalmente ao estiramento C=O dos grupos peptídicos e a de amida II aos estiramento da ligação C-N e deformação angular da ligação N-H, ambas também dos grupos peptídicos. Os -1 -1outros sinais de baixa intensidade entre  3100 e 2800 cm  e abaixo de 1500cm  são devido outras vibrações de menor importância. Os principais sinais da goma xantana, -1figura 1B, são o sinal largo e centrado em 3300 cm , devido ao estiramento das ligações OH (esse sinal ocorre na mesma região das ligações NH das proteínas). O 1 sinal em 1740cm  é típico da goma xantana e é devido aos estiramento C=O dos resíduos de esterificação com o piruvil (CH -CO-COO) e acetil (CH -COO) e ao grupo 3 3-1COOH do ácido glicurônico. O sinal em 1640 cm , devido as deformações angulares da ligação OH dos açúcares, ocorre na mesma região da banda de amida I das -1proteínas. Os sinais intenso entre 1000 e 1150cm , são devido aos estiramentos grupo C-O, presentes em todos os açúcares. Como pode-se ver o sinal da banda de -1amida II é exclusivo de proteínas, o sinal entre 1000 e 1150 cm  é devido somente aos -1resíduos de açúcares e os sinais em 1740 cm  à esterificação da goma xantana. As figuras 1C a F apresentam os espectros de FTIR da Xanthomonas nos intervalos de  2, 4, 6 e 10 dias de cultura. Nestes espectros pode-se ver que são uma combinação dos sinais de proteínas mais o da goma xantana. Na região espectral de -13700 a 1800cm , não foi notada alteração significativa para as diferentes amostras -1de bactéria. Porém na região de 1800 a 900cm , observam-se alterações nos espectros que caraterizam modificações na composição ou/e alterações na concentração química das bactérias.  A principal mudança pode ser observada na -1banda em 1740 cm , que aumenta muito com o tempo de cultura, principalmente no décimo dia de cultura.Isso pode ser melhor observado no gráfico (figura 2) da razão entre as -1intensidade  dos  sinais em 1070 cm   (devido à cadeia glicosídica dos açucares)  e -1 -1em 1550 cm  (devido apenas às proteínas), e da razão entre os sinais em 1740cm  -1(devido aos grupos piruvil e acetato da goma xantana) e em 1550 cm , em função do -1 -1tempo de crescimento da cultura. Como a razão dos sinais em 1070 cm /1550cm ) permanece constante até o sexto dia, pode se concluir que a proporção proteína /polissacarídeos também se manteve constante neste período. No décimo dia teve uma pequena redução dessa razão. O grau de substituição com o grupo acetil/piruvil -1(razão 1740/1550 cm ) aumentou do primeiro para o segundo dia, ficando praticamente constante até o quinto dia e depois aumentou muito, demonstrando que há um aumento significativo do grau de esterificação dos polissacarídeos, para longos tempo de cultura. Essas observações demonstram que a bactéria ao consumir os nutrientes do meio de cultura entra em uma fase de dormência, elevando o grau de esterificação da xantana, que lhe dá maior rigidez estrutural. Com esse demonstrasse também que o FTIR pode ser usado para monitorar tanto a proporção proteínas/goma xantana e quanto o grau de esterificação com os grupos  piruvil e acetato.COMUNICADO TÉCNICOCT/40, CNPDIA, out/2000, p.4-1Figura 2- Gráfico da razão da intensidade dos sinais em 1070/1550 cm  (   ) e -11740/1550 cm  (   ) em função do tempo de crescimento da cultura de Xanthomonas.A Xyllela fastidiosa como o próprio nome diz é uma bactéria com crescimento muito lento, com dezenas de dias de cultura. Os espectros de FTIR da Xylella  com 30 (A) e 70 dias (B) de crescimento estão na figura 3. Esses espectros são típicos de -1 -1bactéria onde se observa as bandas intensas em 3350cm , o pico em 1652 cm  -1 -1(amida I), o pico em 1550 cm  (amida II) e a  banda em aproximadamente 1070cm  é devido a deformação angular C-O, característica de açúcares.Figura 3- Espectros de FTIR de Xylella depositada em janela de silício. A) após 30 dias e  B) após 70 dias de crescimento.1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.20.30.40.50.60.70.80.91.01.11.21.3RazãodaintensidadedossinaisDias de crescimento da cultura(B) 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600(A)Comprimento de onda (cm-1)g  n  COMUNICADO TÉCNICOCT/40, CNPDIA, out/2000, p.5A principal diferença observada nestes espectros da Xylella foi que a banda em -1 1070cm é muito mais intensa em 70 dias do que em 30 dias, demonstrando que há um aumento do teor de polissacarídeos com o tempo de crescimento, o que não foi observado com a Xanthomonas. O aumento do teor de polissacarídeos também pode -1ser observado com o aumento da intensidade do sinal entre 1700 e 1600 cm , que é devido deformação angular dos grupos OH.Quando se compara os espectros de Xylella com os da Xanthomonas não se 1observa a banda em 1740cm , devido ao estiramento C=O do resíduo piruvil (CH -3CO-COO) e acetil presentes na estrutura da goma xantana. Esta observação está de acordo com os recentes resultados publicados sobre a Xylella, a partir do seqüenciamento do seu genoma (Simpson et al., 2000). No genoma  da  Xylella foram encontrados quase todos os genes que codificam as enzimas da síntese da xantana, os genes  gumA, gumB, gum C, e gum F, porém, não foram encontrados os genes gumI, L e G, que incorporam a manose terminal, o piruvato e o acetato, respectivamente. Esses resultados demonstram claramente a potencialidade do FTIR em caracterizar o polissacarídeo extracelular nas bactérias Xylella e Xanthomonas in vivo, bem como sua concentração de maneira rápida e com aproximadamente 1mg de amostra. Essa metodologia desenvolvida acima está sendo usada para avaliar a influência de ions de metais como cobre e manganês no metabolismo da Xanthomonas, principalmente na síntese da xantana. Referências BibliográficasMANTSCH, H.H. & CHAPMAN, D.ed.  Infrared spectroscopy of biomolecules, New York, Wiley-Liss, 1996.SIMPSON ET AL.  The genome sequence of the plant pa    thogen Xylella fastidiosa. Nature, v.406, n.13, p.151-159, 2000.

Uso de FTIR para Análise de Bactérias Causadoras do Cancro Cítrico e CVC.

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