CRUVINEL, P. E.

RABELLO, L. M.

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Infoteca-e

ISSN 1413-9553RECOMENDA˙ˆO TÉCNICA  N°  1 novembro, 1996INSTRUMENTOS DESENVOLVIDOS NO CNPDIAPARA CONGELAMENTO DE EMBRIÕESLadislau Marcelino RabelloPaulo Estevªo CruvinelINSTRUMENTOS DESENVOLVIDOS NO CNPDIAPARA CONGELAMENTO DE EMBRIÕESLadislau Marcelino Rabello1Paulo Estevªo Cruvinel2A tØcnica de congelamento de embriıes Ø atualmente utilizadona agricultura de muitos paises objetivando a escolha e separaçªode matrizes geneticamente superiores tªo bem como a criaçªo debancos genØticos.Esta tØcnica consiste basicamente na coleta, manipulaçªo ecritØrios de congelamento de embriıes, retirados de uma doadoraque foi previamente ovulada e inseminada, para após sercondicionado em baixas temperaturas, como a do nitrogŒnio líquido.Entretanto se os embriıes fossem congelados em nitrogŒnioliqüido imediatamente após a coleta, sofreriam danos em sua camadaexterna devido a cristalizaçªo intracelular e nesse caso morreriam.Para resolver este tipo de problema existem vÆrios procedimentosrecomendados para o congelamento, alØm das tØcnicas de manuseioe preparaçªo, abaixando a temperatura sem danifica-los. O protocolomais usual, para o caso de embriıes bovinos, Takeda (1984), Ø oabaixamento da temperatura, após a coleta, a partir da temperaturainicial ambiente, numa taxa inicial de 1”C/minuto atØ a temperaturade -5”C, estabilizando nesta por um determinado tempo, onde ooperador executa a funçªo denominada seeding, que Ø acristalizaçªo da substância crioprotetora que envolve o embriªo emuma posiçªo logo acima eabaixo do mesmo, com uma pinça mergulhada em nitrogŒnio líquido,como indicado na figura 1.1 Eng. Eletrônico, MSc, EMBRAPA-CNPDIA, Caixa Postal 741, CEP 13560-970,Sªo Carlos, SP2 Eng. Eletrônico, PhD, EMBRAPA-CNPDIA, Caixa Postal 741, CEP 13560-970,Sªo Carlos, SPFigura 1: Processo de cristalizaçªo inicial da substânciacrioprotetora.Após o preparo da amostra na temperatura de -5”C, inicia-seuma fase critica que Ø o abaixamento da temperatura atØ -40” C.Critica porque se deve abaixar a temperatura lentamente e com omínimo de oscilaçıes. É recomendado uma taxa de decaimento de0,3”C/minutos, Takeda (1984) e Schneider (1984). Na figura 2 Øilustrado um exemplo da curva necessÆria para o congelamento deembriıes bovinos.Figura 2: Ilustraçªo das rampas de congelamento.Uma sØrie de equipamentos para congelamento de embriıespodem ser encontradas, desde equipamentos manuais a sistemasautomÆticos os quais permitem a escolha de rampa de decaimentoou de incremento de temperaturas de acordo com a necessidade dooperador.Os equipamentos manuais mais simples consistem de umagarrafa de vidro, cujo interior Ø preenchido com soluçªo de Ælcool,acetona e gelo, conforme ilustra a figura 3a. O controle detemperatura Ø feito colocando gelo seco em pedaços, proporcionalao degrau de temperatura que se quer ajustar. Este tipo de aparelhoexige uma constante dedicaçªo e observaçªo do operador e areproduçªo das rampas de resfriamento nunca Ø obtida.Outra unidade manual, apresenta dois frascos, conforme figura3b. O frasco menor Ø preenchido com Ælcool onde ficarÆ a amostraa ser resfriada. Esta primeira garrafa Ø introduzida dentro de umsegundo frasco maior, que contØm nitrogŒnio liqüido. As taxas deresfriamento ficam em funçªo de parâmetros tais como, quantidadede Ælcool e profundidade do primeiro frasco dentro do nitrogŒniolíquido.A terceira unidade, apresentada na figura 3c, consiste de umtanque de nitrogŒnio líquido, tendo montado na parte superior umcano largo formando um pescoço. A amostra Ø introduzida atravØsdo cano que fica envolto pelo vapor de nitrogŒnio. A temperaturadecrescerÆ à medida que a amostra se aproxima da parte líquida donitrogŒnio. Neste equipamento a taxa de resfriamento Ø funçªo davelocidade que a amostra se desloca desde a entrada atØ a superfíciedo nitrogŒnio líquido.Figura 3: Exemplos de sistemas para o congelamento de embriıescom procedimentos manuais.Os equipamentos comerciais sªo em geral utilizados paraembriıes de espØcies específicas. Nªo permitem grande flexibilidadena escolha das rampas de congelamento, utilizando ainda sistemascomplexos, tal como, a constante injeçªo de nitrogŒnio líquido.Devido a estas limitaçıes, geralmente possuem controles detemperatura dedicados e nªo permitem ao pesquisador buscar novastØcnicas para congelamento de espØcimes conhecidas ou emextinçªo.A automaçªo de sistemas de congelamento de embriıes Øuma prÆtica que vem sendo utilizada a alguns anos por paises comoos Estados Unidos e a França e vem a otimizar o erros dosprocedimentos manuais, principalmente garantindo uma mínima taxade sobrevivŒncia de embriıes após o descongelamento.Entretanto tŒm-se observado que os equipamentos disponíveiscomercialmente sªo em geral dedicados atendendo a protocolos decongelamento com nœmero de rampas prØ-programadas, limitandoaçıes de pesquisa.A EMBRAPA-CNPDIA desenvolveu inicialmente uma versªode sistema de congelamento automatizado com o uso demicrocontrolador, Cruvinel (1992). Ilustrado na figura 4.Com o objetivo de se obter um instrumento que venhapossibilitar açıes de pesquisa nos protocolos de congelamento dediferentes espØcimes a EMBRAPA-CNPDIA desenvolveu o sistemade congelamento computadorizado o qual permite o controle detemperatura entre -40”C a +40”C, bastante flexível nesta faixacom dimensıes compactas, permitindo a escolha das rampasconforme a necessidade do operador, dentro da faixa, paradecrØscimo de temperatura, de 2,0”C/minuto a 0,1”C/minuto.Figura 4 : Sistema de congelamento automatizadoA f igura 5 i lustra o diagrama de bloco do s istemacomputadorizado para congelamento de embriıes. Como se podeobservar o sistema utiliza gÆs refrigerante em substituiçªo aonitrogŒnio líquido, que como jÆ mencionado, normalmente se perdena atmosfera. O sistema de refrigeraçªo Ø composto de evaporador,compressor, condensador e tubo capilar. O evaporador  consiste dedois cilindros de aço inox, com aletas entres as paredes, em formahelecoidal, o que permite que o gÆs em sua expansªo possa ter umaÆrea maior de contato. Uma camada de poliuretano envolve oevaporador para isola-lo do meio ambiente.O gÆs refrigerante utilizado foi o R-502, de alta capacidade deproduçªo de frio, tendo uma temperatura de evaporaçªo de       -45”C.Dentro do evaparador, na câmara de congelamento dosembriıes, com a finalidade de aquecer a câmara para anular aconstante açªo do frio, controlando a temperatura na faixa desejada,utilizou-se uma resistŒncia elØtrica de forma helicoidal. A temperaturada câmara Ø lida por meio de um sensor termo-resistivo. O blocoindicado por sistema de potŒncia atua como interface de controle,recebendo um sinal do computador e convertendo-o a um níveladequado de energia para a resistŒncia no ato de controle detemperatura. O controle e a programaçªo de protocolos decongelamento sªo realizados pelo acoplamento de um computadorPC compatível.Figura 5: diagrama de bloco do sistema computadorizado paracongelamento de embriıesA figura 6, ilustra o sistema de congelamento de embriıescomputadorizado desenvolvido na EMBRAPA-CNPDIA.Figura 6: Sistema computadorizado para congelamento deembriıes desenvolvido na EMBRAPA-CNPDIA.Esse sistema apresenta flexibilidade na programaçªo paraajudar no processo de controle de congelamento de embriıes.Flexibilidade, quando comparada à de outros equipamentos,possibilita a operacionalidade automÆtica tanto para protocolosconhecidos para o congelamento de embriıes como para novos,viabilizando assim as açıes de pesquisas.Resultados sem o uso direto pelos produtores, mas de interesseda pesquisa, mostram o estudo e o projeto de um sistema versÆtilpara o congelamento de embriıes, com flexibilidade de programaçıese a otimizaçªo de desenho mecânico para um congelador deembriıes. Resultados de uso direto pelos produtores mostraram apossibilidade da conservaçªo de embriıes por tempo praticamentenªo-limitado, a nªo necessidade de sincronizaçªo entre as doadorase receptoras de embriıes, a escolha da data do parto, a possibilidadedo transporte de embriıes a longas distâncias e o desenvolvimentode tecnologia nacional nessa Ærea.REFER˚NCIAS BIBLIOGR`FICASCRUVINEL, P.E.; RABELLO, L.M.; BERTUCCI NETO, V.; BEM, A.R.;CASAGRANDE, J.F.; ALMEIDA, C.A.; QUEIROZ, F.H.  Sistemaprogramado para o congelamento de embriıes.  In: ENCONTRONACIONAL DE F˝SICA DA MATÉRIA CONDENSADA, 16,Caxambu-MG, maio 1993.  Resumos estendidos do Grupo deInstrumentaçªo...  Sªo Paulo: Sociedade Brasileira de Física, 1993.p.64-67.RABELLO, L.M.  Sistema computadorizado para congelamento deembriıes.  Sªo Carlos: USP-EESC, 1993. 226p.  Tese MestradoRABELLO, L.M.; CRUVINEL, P.E.; BERTUCCI NETO, V.  A automaçªode um sistema para o congelamento de embriıes.  In:CONGRESSO BRASILEIRO DE AUTOM`TICA, 10 E CONGRESSOLATINO-AMERICANO DE CONTROLE AUTOM`TICO, 6, Rio deJaneiro-RJ, set. 1994.  Anais...  Rio de Janeiro: SociedadeBrasileira de AutomÆtica, 1994.  v.1, p.454-458CRUVINEL, P.E. et al. coordenador Sistema programado paracongelamento de embriıes, resumo do relatório: Sªo Carlos-SP,EMBRAPA-NPDIA, 1992 36p. Projeto n” 801.87.009/7 concluído.TAKEDA, T. Equipament for cooling embryos. In: Techniques forfreezing mammlaian embryos. Colorado : Embryos TransferLaboratory Animal Reproduction, Colorado State University p.51-55. 1984.SCHNEIDER, U.;  MAZUR, P. Osmotic consequences ofcryoprotectant permeability and its relation to the survival offrozenthawed embryos. Theriogenology, v.21, n.1,p.68-79, 1984.

Instrumentos desenvolvidos no CNPDIA para congelamento de embriões.

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Instrumentos desenvolvidos no CNPDIA para congelamento de embriões.

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